病理技术探讨冷冻切片制作技术

第一节冷冻切片的意义

冷冻切片在组织学技术中应用最广泛，特别是对临床手术病人在术中快速病理诊断及科研中的免疫组织化学诊断研究具有重要的意义。冷冻切片是采用冷冻的方法使组织在较短时间变硬切成薄片，其原理是利用物理降温的方法，使组织达到一定的硬度进行切片的一种方法；冷冻后组织中的水分起着包埋剂的支撑作用，因此，组织可以切成很薄的切片，应用于各项检查。冰冻切片最常用于：

一、快速诊断冷冻切片可称之为病理科的急诊工作，常用于临床手术科室快速组织学诊断，特别是在手术进行当中取出病变组织，要求病理医师在很短的时间内做出良、恶性的正确的诊断，为临床医师下一步的手术方案及治疗提供指导。

二、显示组织中脂质对脂肪和类脂的保存较好，在检查脑组织中的脂肪栓塞，鉴别卵巢的泡膜细胞瘤（含有脂质）和卵巢纤维瘤、脂肪肉瘤的诊断以及脂质贮留性疾病等。染脂肪染色和神经组织髓鞘的染色等常用于冰冻切片。

三、显示酶活性酶组织化学已广泛应用于临床，这是一个很重要的研究方法。酶的方法主要应用于肌肉活检的检查，在组织化学上显示酶的活性。

四、免疫荧光的研究在迅速发展的免疫荧光诊断技术工作，冰冻切片是最重要的方法。特别是对肾脏活检的免疫荧光标记检查是相当重要的，因为在肾小球内的抗体和抗原抗体复合物的性质及分布有着重要的诊断意义。第二节冷冻切片的发展史

年HalsteddeRiemer首创冷冻切片技术，年LouisBWilson在MayoClinic成功地完成了第一例冰冻切片诊断，距今已有多年的历史。年，ArchPatholLabMed发表了纪念冷冻切片周年的文章。冷冻切片机始源于半导体冷冻装置，是利用Peltier效应。当一块N型半导体和一块P型半导体连结成电偶对，在这个电路中接上一个直流电源，电偶上流过电流时，就发生能量转移。在一侧接头面吸收能量可产生-25℃的温度，而在另一侧接头面通过流动自来水排放出能量可产生+25℃的温度，低温温度是通过直流电和流动自来水来控制调节的，在达到适合切片温度后即可工作。第一台冷冻切片机是由丹麦Lederstrom-Lang和Mogensen在年创造的，用于定量组织化学研究，后来由Coons,Leduc和Kaplan设计改进成新型恒温冷冻切片机，温度可降至-30℃。恒温冷冻切片机的问世，使冷冻切片不受气候、室温等外界因素的影响，可以在一个相对恒定的环境下进行工作。一百多年来，冷冻切片已被用来做为一种工具，主要应用于临床外科手术中对患者进行快速诊断，并在此基础上立即决定手术方案、范围及治疗方法，医院及医疗机构都已具备了开展冷冻切片的条件。随着科学的发展和不断进步，新型的冷冻切片机不断问世，并且在逐年更新，一批批新发明的、半自动化的、全自动化的冷冻切医院和科研机构。冷冻切片机设有单压缩机和双压缩机，医院及科研机构应用有Leica；；；s等恒温冷冻切片机；Shandon恒温冷冻切片机；SAKURA恒温冷冻切片机；LeicaCMXP大型冷冻切片机；浙江金华益迪恒温冷冻切片机等。第三节恒温冷冻切片机的结构与功能

一、结构恒温冷冻切片机主要由冷箱体及切片机构成，每种型号都根据了人体工程学原理设计、操作方便、安全省力，具有快速双重制冷、自动除霜、自动消毒、具有负压等功能，精密的切片装置、先进的制冷系统、安全与环保性能保证了制作优良冷冻切片。

二、功能是利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理，因此制片速度快，是为术中提供快速病理诊断的良好方法。此外由于冷冻切片未经固定的新鲜组织，因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些免疫组织化学染色和原位分子杂交的理想制片方。第四节冷冻切片组织的取材

组织取材大小对制片的影响极为重要，取材时应注意以下几点：一、标本必须新鲜无固定，无液体浸泡二、组织块大小厚薄适宜三、组织块勿受挤压四、尽量保持组织的原有形态五、选择好组织切面六、保持组织的清洁七、切除不需要的部分，遇有脂肪组织要剔除八、组织内有异物一定要清除第五节冷冻切片机的温度设置

病理技师在短时间内要制出高质量的冷冻切片，而且更需要病理技师具有娴熟技术，对冷冻切片原理的理解，对病理医师诊断需求的理解，对冷冻切片机功能的合理应用是至关重要的。冷冻切片的重要环节是温度与切片的关系，组织温度的变化可影响其软硬程度。温度升高组织块变软，稳定降低则组织变硬。不同组织冷冻切片的冷冻温度调整原则是：柔软稚嫩富含水分的组织选择相对较高的温度，如较低的温度易造成切片呈碎屑状；较为致密富含脂肪的组织选择相对较低的温度，较高的温度易造成切片堆积不能形成片状。以下是部分组织冷冻切片的温度参数值：

－10℃至－15℃：淋巴结、肾上腺、脑组织、脾脏、子宫内膜。－16℃至－25℃：乳腺、肺、胆囊、子宫、小肠、结肠、肾、肝脏、肌肉、胰腺、前列腺、皮肤、甲状腺等。－25℃至－35℃：富于脂肪的乳腺组织、纤维脂肪组织、富于脂肪的皮肤组织、富于脂肪的肿瘤组织第六节冷冻切片的制作方法

一、冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻头温度和箱内温度调整到适宜的切片温度，一般情况下为－18℃――25℃

二、在标本托上涂一层冷冻包埋剂—OCT，然后将取材后的新鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT包埋剂覆盖标本。

三、组织较小或较薄，可先将OCT滴加在标本托上，冻一个小冷台，将组织放在制成小冷台上，再覆盖OCT冷冻并用冷冻锤轻轻压平。

四、标本冷冻完成后将标本托固定再切片机的机头上，调整机头的位置使其恰好位于切片刀的后方。

五、以粗切削的方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平面，使用连续转动方式削5－6个切面后，用毛笔清除机头、标本托及切片刀上的组织碎屑。

六、确认切片厚度，一般6μm－10μm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄度。

七、放下防卷板使其位置恰好与切片刀的刀刃完全平行并略突出刀刃。

八、以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在防卷板下方形成一张完整平坦无褶的薄片，如切片略有弯曲可用小毛笔轻轻展平切片。

九、打开防卷板，用载玻片平稳地轻压组织，使其平整地吸附到载玻片上（载玻片要保存在室温条件下）。

十、也可不使用防卷板，用毛笔轻带组织下方的白边（OCT），随机器的慢慢转动，用毛笔轻轻从上至下展开组织，使其平坦，组织齐全满意时，用毛笔轻轻压住切片的下方，右手拿载玻片轻轻平稳地压组织，使其平整地吸附在载玻片上，迅速放入固定液，进入染色程序。在切片时一张玻片上不要放两个组织切面，因为在切第二张切面时，第一个切面由于天气炎热、潮湿，切片组织细胞退化变形，影响染色及诊断。

十一、正确地调整使用冷冻切片机的防卷板是获得平展完整冷冻切片的重要手段，防卷板的正确位置是，与切片刀的刀刃平行并略微突出于刀刃，如防卷板过度突出与刀刃会造成切片机头上的组织与防卷板相撞，如防卷板低于刀刃会造成切片向上卷曲不能形成平整的切片，在调试时从下向上逐步提高防卷板的位置，每提高一点切一张切片测试，直至切片能在防卷板下形成完整平展的切片为止。第七节冷冻切片的固定和染色

一、冷冻切片的固定、固定液的选择冷冻切片的固定液种类：1．丙酮液2．10％中性福尔马林缓冲液3．95％酒精4．乙醚与纯酒等量混合固定液5．A、F液6．A、F、A液可根据工作要求选择适合于本单位的固定液。

二、冷冻切片染色1．冷冻切片应立即放入固定液中2．固定一分钟左右，水洗3．入哈瑞氏苏木素染液2分钟，水洗4．1％盐酸酒精分化数秒，水洗5．0.5％氢氧化铵水溶液返蓝数秒，水洗6．入1％水溶性伊红染液1—2分钟左右，水洗7．70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、95％乙醇逐级脱水，8．无水乙醇脱水三次9．二甲苯透明两次10．中性树胶封固

三、冷冻切片的标准1．操作正确2．切片完整3．厚薄均匀4．无褶无刀痕5．组织内无冰晶6．核浆分明，染色适度7．组织结构清晰8．脱水透明洁净9．封裱美观10．时间迅速

四、冷冻切片染色的注意事项1．提倡使用新鲜苏木素染液，每天过滤，防止沉渣及结晶的形成，保证高质量的冷冻切片以利诊断。2．室温过低时，影响着色，可适当加温促进染色。3．盐酸酒精分化应适度，显微镜下控制，否则易造成核着色不佳，染色质不清晰，影响诊断。4．氨水返蓝要适度，浓度过高易脱片，一般配成0.2%—0.5%为宜。

五、冷冻切片冰晶的控制冰晶形成取决于组织含水量的多少，尤以组织细胞水肿、淋巴结、纵隔肿瘤、卵巢肿瘤为甚，还有在取材过程中接触到水源，冷冻过程中速度慢，使用液氮时间上未控制好等，蛋白质与水形成的胶状体受到破坏，水分从胶体状态的蛋白质中分解出来，这些都是造成冰晶形成的原因。解决的方法：使用液氮时间上应控制好，组织取材中，应避开水源，如遇含水量高的标本时，用干纱布或滤纸吸干水分后再进行冷冻。在使用液氮时，动作要快。第八节恒温冷冻切片机的使用注意事项及日常维护

冷冻切片机应严格遵守操作规程。切片前，厚度应预先调制好，刀具应提前安放好。刀的角度调好位置，并多备几个冷冻托，以供速冻组织块使用。切片时，观察窗不可打开过大，以防温度升高影响切片。同时呼气时不要对着组织块，这些都会对冷冻切片造成影响。每一例冷冻切片完成后，都应及时清理冷冻组织碎屑，以防造成污染。冷冻切片完成后，应彻底清洁箱体内的组织碎屑，擦拭机器，并对机器的加油孔注入低温冷冻油，润滑机器。最后，开启机器消毒功能，对机器进行消毒。切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片粗削后必须要用毛笔清洁碎屑，以防其它组织碎屑沾染到正在进行切片的标本上。冷冻切片机的温度：白天工作时温度可设定在－20℃至－25℃之间，如遇到脂肪标本时，可快速调至－30℃以上。全部冷冻切片工作完成后，应对箱体内进行卫生清理，用毛刷除去碎屑污物，放上10％的福尔马林固定液进行熏蒸消毒，并将温度调至－20℃，早上工作时再将温度调至所需温度既可，如有条件，机器应定期关机，拔掉插销，待机器恢复室温后，对切片机各部件进行彻底清洗，滴加上专用的防冻润滑油，接通电源，调至－20℃以备工作之用。

（本文作者：医院王德田教授，摘自《实用现代病理学技术》精装，中国协和医科大学出版社。本文已授权，如要转载请注明转自“优纳科技

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