冷冻电镜解析人源TAG合成酶的结构和催化
近日，哈佛大学公共卫生学院及医学院的MaofuLiu,ToblasC.Walther和RobertV.FareseJr三名教授合作，在Nature上发表了”Structureandcatalyticmechanismofahumantriacylglycerol-synthesisenzyme”一文。作者利用冷冻电镜的方法，在3.0?分辨率水平对人源甘油三酯(TAG)合成酶，即acyl-CoAdiacylglycerolacyltrasferase1(DGAT1)酶的二聚体结构进行了解析。同时，作者在3.2?分辨率水平解析了油酰辅酶A(Oleoyl-CoA)与DGAT1结合时的构象。进一步结合突变-功能研究，作者揭示了DGAT1与底物相互作用机制，并提出了DGAT1催化合成TAG机理的模型。
TAG在生命体中承担能量储存功能，TAG的过量累积会导致人的肥胖以及其它代谢疾病。哺乳动物中，TAG的合成由DAGT1和DAGT2酶催化完成，其结构和催化机理目前均不明确。其中DGAT1是内质网膜上的多次跨膜蛋白，具有保守的His残基，与固醇及蛋白酰基化酶同属于membrane-boundO-acyltransferase(MBOAT)家族。该家族中，催化丙酰基向磷壁酸转移原核生物的DltB酶近年被解析过。在本文中，作者解析了合成脂质的人源DGAT1未结合/结合底物的结构，并提出了其催化机理。
作者将纯化的DGAT1酶用PMAL-C8两性分子重构，观察到催化活性相似的二聚体和四聚体两种形态。作者用冷冻电镜对二聚体结构进行了3.0?分辨率的解析，除N端的起始65个氨基酸和-的环区外，可清楚定位大部分氨基酸残基。
DGAT1单体有9个跨膜螺旋结构，另有平行于膜表面的短螺旋CL2-CL4和LL1结构。DGAT1二聚体依靠细胞质表面的沟与解析到的69-87号氨基酸的氢键，以及TM1间的疏水相互作用形成，另外，作者在二聚体界面观察到疑似对应4个磷脂(PE)的电子密度。
DGAT1的跨膜螺旋在中心形成一个大洞穴，通过一个宽的横向门与磷脂双分子层相连，同时也通过两侧开口与细胞质和内质网腔相连。与DltB结构对比，两者都具有保守的His位点藏于洞穴内部，跨膜螺旋在两侧形成凹槽结构，因此作者定义此保守结构为MBOATcore。在MBOATcore中，DGAT1具有与DltB丙酰基给体结合口袋相似的通道区域。然而，DGAT1独有横向门(lateralgate)结构，预示DGAT1催化的受体甘油二酯(DAG)是从膜中通过横向门到达活性位点的，而DltB的受体磷壁酸位于胞外无需此结构。突变His及其周围的氨基酸残基显著降低DGAT1的活性，表明中心洞穴是该酶催化位点。
随后，作者在3.2?分辨率下解析了结合完整油酰基辅酶A底物的DGAT1结构。油酰基辅酶占据了细胞质侧通道，辅酶A位于细胞质侧，酰基链从反应中心向内质网腔延伸，此朝向与酰基辅酶A在内质网上合成时一致。酰基辅酶A与DGAT1的相互作用主要依靠4’-phosphopantetheine部分，结构可在冷冻电镜中清晰表征，且此部分氨基酸残基突变可导致DGAT1活性的下降。酰基链的远端处于DGAT1疏水通道中，表明长链酰基链可能能帮助定位酰基给体，这与DGAT1面对长链底物活性更高一致。与其它MBOAT家族序列比较表明，酰基链结合通道是MBOATcore中最为保守的序列。对比未结合/结合底物的DGAT1结构，整体结构无较大差异，但酰基辅酶A断键位点附近残基构象改变。结合底物后，His与Met间氢键断开，而与Gln形成新的氢键，使His朝向酰基辅酶A硫酯键。
另外，作者在未结合/结合底物的DGAT1的中央洞穴中均观察到类似脂质的电子密度，与结合的油酰基辅酶A处于垂直位置，靠近His。此结果与在纯化蛋白中存在DAG的电泳结果一致。该密度处于疏水残基形成的弯曲通道中，弯曲结构可能是DGAT1可筛选DAG而非固醇等结构的原因。作者也观察到了硫酯键已断开的油酰基辅酶A结合的DGAT1结构，酰基链与垂直的密度相结合，形成TAG类似的密度图像。
总之，作者成功用冷冻电镜技术在3?水平解析了人源DGAT1未结合/结合底物的结构，揭示了二聚体、底物结合位点、催化位点的分子机制，提出了催化过程模型：酰基给体从细胞质进入DGAT1，辅酶朝向细胞质侧，酰基在His附近转移至与之垂直的DAG受体，随后辅酶A释放至细胞质，TAG释放至细胞膜内，开始脂滴的形成。这一研究有助于DGAT1抑制剂的开发，以及TAG相关疾病的研究。
文章来源：Sui,X.;Wang,K.;Gluchowski,N.L.;Elliott,S.D.;Liao,M.;Walther,T.C.;Farese,R.V.,Jr.,Structureandcatalyticmechanismofahumantriacylglycerol-synthesisenzyme.Nature,(),-.
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