论文解读NAJA，海洋鱼类精子冷冻保存

今天分享一篇发表在NorthAmericanJournalofAquaculture上的文章，该文的引用信息如下：

部分水生物种因其精子体积的大小（μL）,被限制无法人工大规模繁育。因此，需要评估新的精子保存方法。

水生物种中的冷冻保存技术，可以控制雌性产卵的灵活性，更好地控制育种计划以及长期保存有利基因，能加强孵化场和水产养殖业的运作。其中玻璃化冷冻法可以保存有价值的物种基因以及建立有价值的生物医学模型体系，保存突变体用于开发观赏的水产养殖新品种等。

本文中评估对象为南方比目鱼（Paralichthyslethostigma）的精子，采用玻璃化冷冻法进行了一系列实验，以达到以下四个目标（1）评估解冻方法和玻璃化溶液，（2）评估在不同冷冻保护剂溶液中玻璃化后再解冻膜的完整性。（3）检查膜完整性和运动性之间的关系。（4）评估玻化过的精子使卵子受精的能力。

实验方法如下：

采样进行精子活力以及浓度评估后：1、将精子放置在抑制活力的盐溶液SMIS中并稀释到2×个细胞/mL的浓度。2、对于玻璃化的精子样品，以1:1（v/v）的比例与冷冻保护剂混合。立即将样品（15s内）加样到10-μL聚苯乙烯环中，并在加入冷冻保护剂溶液1分钟（?50s）内快速浸入液氮中。在液氮中储存至少12h后，将玻璃化样品在室温（24°C）或其他温度下直接解冻到含有30μL海水（?1,mOsmol/kg）的显微镜载玻片上，估计30s内解冻精子的活力。

实验一：探究解冻温度的影响，一共有如下六个实验组，所用的冷冻保护剂是：二甲基亚砜（DMSO），乙二醇（EG），1,2-丙二醇（PROH）和甘油（Gly）。（1）20％DMSO+20％EG，（2）20％DMSO+20％PROH，（3）20％DMSO+20％Gly，（4）20％EG+20％PROH，（5）20％EG+20％Gly，（6）20％PROH+20％Gly。采用上述方法实验。

实验二：不同玻璃化液的评估：三个实验组，分别是（1）20％EG+20％Gly，（2）10％DMSO+30％EG+0.25MTre（海藻糖脱水物）（3）15％DMSO+15％EG+10％Gly+1％X-1+1％Z-1（DEGXZ）。一般的玻璃化程序进行。在室温（24°C）直接解冻到含有30μL海水的显微镜载玻片上。解冻后立即估计每个样品的运动性。所有试验重复两次。

实验三：玻璃化溶液对膜完整性的影响。:三个实验组(1)20%DMSO+20%EG，(2)20%DMSO+20%Gly，(3)20%EG+20%Gly。采用SYBR14-碘化丙啶染色组合进行评估。

实验四：受精实验：基于上述实验的结果，1、用加入冷冻保护液20％EG+20％Gly组合玻化后解冻的精子进行实验。2、不加冷冻保护液玻化解冻后的精子进行实验。

结果显示：

实验一：新鲜精子在玻璃化前的运动能力为50±10％（平均值±SD）。实验中，20％EG+20％Gly和20％DMSO+20％Gly运动能力最高，为35％。表1所示，在所有处理中，21℃或37℃下解冻的精子活力没有显着差异（P=0..05）。

实验二：新鲜精子在玻化前的动力是60±10％（平均值±SD）。实验中，20％EG+20％Gly的后活力最高，是40％，接着是15％DMSO+15％EG+10％Gly+1％X-1+1％Z-1（DEGXZ）的30％。表1所示，这两种方法精子在运动能力上有显著差异（P=0..05）。10％DMSO+30％EG+0.25MTre的运动性（7±3％）与DEGXZ的运动性（14±10％）差异不显著（P=0..05），但与20％EG+20％Gly的运动性（28±9％）差异显著（P=0.）。

实验三结果如表2所示，新鲜精子活力（57±9％）与膜完整细胞（89±1％）呈正相关（r=0.80），但有显著性差异（P0.））。表2所示中，在所有的处理中，解冻的精子活力和膜完整性之间没有相关性。

实验四结果如表3所示，年使用的三条雌性中，只有一只获得了可用的卵（对照中受精率20％）。其中一条雄性的玻璃化精子的受精率与新鲜精子对照相同。但另外两条雄性的玻化精子受精率较低（5％）。无防冻剂的玻璃化精子无受精能力。年使用的八条雌性中，使用了四条受精率9％的雌性的数据。在雌性1,2和3使用相同的雄性中，实验数据缺失。在受精试验中，雄性与雄性之间具有差异。例如，雄性2与雌性1产生23％的受精，而雄性3与同一雌性产生6％的受精率。

玻璃化冷冻法这种低温保存方法，为遗传物质的保存提供了新的途径。应用玻璃化方法最大的挑战是配制适当的玻璃化溶液，并开发出合理的平衡和稀释程序，以减少渗透和毒性损伤等。

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