冷冻切片免疫组化染色最佳固定条件探讨
来源：智慧病理网
投稿作者：马恒辉（医院病理科）
——本文系作者投稿，未经授权，不得转载。
王璇，吴楠，章如松，魏雪，杨万锐，饶秋，马恒辉
作者简介：王璇，女，硕士，主管技师。
马恒辉，男，副主任技师，通讯作者。
冷冻切片是借助低温使组织达到一定的硬度来制作切片的一种方法，是免疫组化常用的切片方法之一，能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，并且能检测石蜡包埋组织不能检测的抗原，已越来越多地应用于科研或快速病理诊断。冷冻切片免疫组化的染色效果受众多因素的影响，文献报道固定是影响冷冻切片免疫组化染色的关键因素[1]。固定的目的不仅使细胞内蛋白质凝固，抑制酶活性，更重要的是最大限度地保存细胞和组织的形态结构和抗原性，防止抗原弥散和丢失。如果固定不当，会导致组织破坏、结构不清晰、定位不准确，对随后的免疫组化染色产生很大影响。因此，我们选用4种不同的固定液分别对冷冻切片进行短时间和长时间固定并进行免疫组化染色，旨在找出适合本实验室冷冻切片免疫组化染色的最佳固定条件，以便更好地满足临床及科研工作的需要。
1材料与方法
1.1材料收集医院年5月至年7月送检的新鲜手术切除标本15例，其中乳腺6例、肺5例、甲状腺4例。
1.2设备德国LEICACM冷冻切片机。
1.3试剂固定液：（1）冷丙酮：置于4℃冰箱保存备用；（2）95%乙醇；（3）10%中性福尔马林；（4）AAF液：95%乙醇85ml、40%甲醛10ml、冰醋酸5ml。抗体：E-cad、GATA3、CK5/6、P63、TTF-1、CKpan、CK7、CK19均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；HRP标记的鼠兔通用型二抗（K）及DAB显色液均购自Dako公司。
1.4方法将冻头放入冷冻切片机，待冷却后，将新鲜取材的组织置于滴有少许OCT包埋剂的冻头上，冷冻至适宜硬度后每例标本以6μm厚度切片12张，分别置于4种不同固定液（冷丙酮、95%乙醇、10%?中性福尔马林、AAF液）中固定5min和2h，并对经10%中性福尔马林和AAF液固定的各2张切片进行热修复。乳腺标本行E-cad、GATA3、CK5/6、P63免疫组化染色，肺标本行TTF-1、CKpan、CK7免疫组化染色，甲状腺标本行TTF-1、CK19免疫组化染色，具体步骤如下：将已固定的冷冻切片用PBS冲洗3次；每张切片滴加μL一抗，37℃孵育20min，PBS冲洗；滴加μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠兔通用型二抗（K）37℃孵育10min，PBS冲洗；DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
1.5染色质量评价每张切片按照组织结构，细胞形态，阳性强度，阳性定位，背景5个指标进行综合评价：用数字3、2、1、0代表优、良、中、差分别对单项指标进行评分，计算平均值，5个指标平均值相加即为总平均值。
2结果
乳腺、肺、甲状腺组织的冷冻切片采用4种不同固定液固定，与其对应的石蜡切片免疫组化相比均未出现假阳性和假阴性染色，均可满足快速病理诊断的需要，但染色细节存在差异。从组织结构、细胞形态、阳性强度、阳性定位、背景5个方面综合分析，AAF液的染色效果优于其他3种固定液，其次为95%乙醇、10%中性福尔马林、冷丙酮；就阳性强度而言，冷丙酮最强，其次为AAF液、10%中性福尔马林、95%乙醇（表1，图1）。冷冻切片固定5min和2h，除固定2h阳性强度略强于固定5min外，其他方面均无明显差异。10%中性福尔马林固定的切片经热修复后与未修复相比组织脱片破损严重，组织结构不清晰，细胞恢复正常大小；AAF液固定的切片经热修复后与未修复相比有轻微脱片，其他方面无明显差异。
3讨论
乳腺病变尤其是乳腺乳头状病变的术中定性诊断是业内公认的诊断难点，仅凭冷冻切片HE染色难以判定肌上皮细胞是否存在，只有通过免疫组化染色标记肌上皮细胞后才能明确诊断[2]；乳腺癌前哨淋巴结活检可准确预测腋窝淋巴结的转移状况，阴性者不再行腋窝淋巴结清扫已经成为早期乳腺癌治疗的共识，但前哨淋巴结微小转移癌与窦组织细胞和异位的痣细胞难以鉴别，导致延迟诊断和假阴性诊断[3]。石蜡切片免疫组化通常组织需要脱水机过夜处理，并且检测时需要抗原修复，根本无法满足术中快速诊断的时限要求。冷冻切片免疫组化具有步骤简单、操作时间短、抗原保存好等优点，可以辅助乳腺术中诊断，从而较快地为临床确定治疗方案提供依据。此外，冷冻切片免疫组化可对低分化癌与肉瘤、未分化上皮性或间叶性恶性肿瘤与淋巴瘤等疾病进行鉴别诊断，并可广泛应用于肺部病变、脑肿瘤等部位病变的诊断中。
固定是影响冷冻切片免疫组化染色的关键因素，用于免疫组化的固定液种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。选择最佳固定液的标准是：（1）最好地保持细胞和组织的形态结构。（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。本研究选用乳腺、肺、甲状腺3种新鲜标本，冷冻切片后采用4种不同固定液固定，与其对应的石蜡切片免疫组化相比均未出现假阳性和假阴性染色，均可满足快速病理诊断的需要，但染色细节存在差异。冷丙酮固定的冷冻切片，组织脱片严重、结构不完整，细胞轮廓不清晰，细胞核皱缩，延长固定时间并不能改善，说明丙酮固定作用不强，但它对抗原的封闭作用小，抗原保存的含量高，进行冷冻快速免疫组化染色时，阳性是4种固定液中最强的。95%乙醇有固定兼脱水作用，因其脱水能力较强，可导致组织、细胞形态轻度皱缩，但固定速度快、细胞轮廓清晰、对抗原保存较好。10％中性福尔马林含4%甲醛及维持pH值和渗透压的盐，可使蛋白质分子发生交联，适合绝大多数组织的固定，固定效果较好；本研究用于冷冻切片免疫组化固定时会使组织和细胞有一定程度的皱缩，并且E-cad出现了较多的胞浆染色；固定2h后阳性强度不仅没有减弱还略强，说明甲醛与组织发生交联需要一个过程，固定2h抗原决定簇可能还未被封闭，抗原不修复依然能被检测到。AAF液中的乙醇起快速固定作用，甲醛固定速度慢、起补充固定作用，而冰醋酸既可抵抗甲醛和乙醇对组织细胞的皱缩又有助染作用；上述三种试剂按一定比例混合，可以发挥各固定液的优点，使冷冻切片免疫组化的组织结构清晰、细胞无皱缩，形态更接近于石蜡切片，染色效果优于其他3种固定液。
冷冻切片固定2h除阳性强度略强于固定5min外，其他方面均无差异，而固定2h时间过长且染色效果并没有明显优势，因此我们仅用作最佳固定条件的探讨，并不推荐于快速病理诊断。10%中性福尔马林或AAF液固定的切片经热修复后与未修复相比均有组织脱片破损情况，并且抗原修复增加了操作步骤和时间，在冷冻切片免疫组化染色时该步骤不需进行。
目前，现有的术中快速免疫组化技术主要包括改良的EnVision两步法[4]、直接免疫组化法[2-3]以及微流体装置结合免疫组化技术[5]。直接免疫组化法需要用多聚辣根过氧化物酶标记的各种抗体，微流体需要特殊装置，应用均受限。我们采用改良的EnVision两步法，通过提高孵育温度和一抗浓度来缩短免疫组化反应的时间，且不需要酶标记抗体和特殊装置，更易于推广。
综上，冷冻切片进行免疫组化染色，AAF液的固定效果优于其他3种固定液；采用AAF液对冷冻切片固定5min且不修复，整体操作时间短、染色效果好，是冷冻切片免疫组化染色非常理想的固定条件。
参考文献
[1]张大红，王琳，李庆明．不同固定剂对免疫组织化学染色效果的影响[J]．实用医技杂志，，1(12)：-．
[2]宋欣，刘梅，杨丽，等．术中快速免疫组化在乳腺乳头状病变诊断中的应用[J]．诊断病理学杂志，，24(10)：-．
[3]刘梅，李席如，宋欣，等．术中快速直接免疫组化在乳腺病变和前哨淋巴结诊断中的应用[J]．诊断病理学杂志，，25(3)：-．
[4]孔静萍，周浩杰．快速免疫组化技术检测CK5／6和P63在乳腺肿瘤冰冻切片诊断中的应用[J]．现代实用医学，，25(6)：-．
[5]BrajkovicS，DupouyDG，deLevalL，eta1．Microfluidicsforrapidcytokeratinimmunohistochemicalstaininginfrozensections[J]．LabInvest，，97(8)：-．
图1采用不同固定液固定5min且不修复，CK5/6在乳腺组织中的表达冷丙酮固定，组织脱片严重、结构不完整，细胞轮廓不清晰，细胞核皱缩，阳性最强（A）
图%乙醇固定，组织结构完整，细胞轮廓清晰，细胞核轻度皱缩，阳性较强（B）
图%中性福尔马林固定，组织结构完整，组织和细胞严重皱缩，阳性较强（C）
图1AAF液固定，组织结构清晰、细胞无皱缩，形态更接近石蜡切片，阳性强（D）
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