409如何提高冷冻切片的技术水平
作者：马恒辉，周晓军
来源：临床与实验病理学杂志
冷冻切片是一种组织不经过脱水、透明处理，不需石蜡包埋的制片方法[1-3]。冷冻切片分为直接冷冻切片法和明胶冷冻切片法[4]。前者根据组织的制冷方法不同有半导体制冷切片法、甲醇制冷切片法、二氧化碳制冷切片法和低温恒冷箱冷冻切片法。目前，比较常用的方法是低温恒冷箱冷冻切片法。为了提高冷冻切片的技术水平，本文就新鲜未固定组织与固定组织的冷冻切片、冷冻切片的温度、冷冻切片的冷冻与冰晶、低温恒冷箱冷冻切片技术、与冷冻切片技术相关的一些问题以及冷冻切片的注意事项，进行交流讨论。
1、新鲜未固定组织与固定组织的冷冻切片
1.1新鲜未固定组织的冷冻切片
组织作冷冻切片最好新鲜，标本尽可能快速冷冻可以避免产生冷冻的人为改变。合适的冷冻技术所使用的冷冻剂包括：液氮（-℃）；异戊烷（在液氮中冷却可达-℃）；干冰（-70℃）；二氧化碳气体（-70℃）；气雾状喷雾制冷剂（-50℃）。最好的冷冻切片往往是从冷冻较快的组织获得，冷冻剂的最佳选择是异戊烷和液氮。使用液氮的问题在于组织周围易产生空泡，类似绝缘物一样，阻止快速均匀冷却组织，导致组织冷冻人为改变，给病理医师的诊断带来困难，这一点对肌肉活检标本来说特别明显。液氮和异戊烷可以联合使用，速冻的方法是：在保温瓶中准备液氮约ml，在小烧杯中准备异戊烷约50ml，将盛有异戊烷的烧杯置于液氮中，预冷至无气雾。注意两种物质不能相混。准备一个导热性能好的金属底托预冷，放少量OCT，置于-20℃低温恒冷箱切片机内，待底托上的OCT开始冻结时，将取好的组织块放置于上。用长镊子夹住底托，组织朝上，迅速浸入异戊烷中，速冻20～30s，即可取出。可以在室温中稍许放置1min左右，待组织标本升温至-20℃，便可开始切片。为防止组织破裂，减少冷冻的人为改变，可以事先将组织在滑石粉上轻轻碾平。固体二氧化碳简称干冰，也可用来冷冻组织块。这一方法并不，因为干冰在储备阶段容易化为气体。操作时须戴上手套取出干冰，对着冷冻夹头上用包埋剂（如OCT）包埋的组织，待组织周围的包埋剂发白时，即可移去干冰，防止组织冷冻过头而影响切片。关于二氧化碳收集，用一个二氧化碳汽缸储备即可获得，通过调节一个常规的冷冻切片机，其组织夹头带有气体或二氧化碳的循环箱，达到组织块冷冻的目的。雾状喷雾制冷剂在冷冻小块组织比较常用。提供该类制冷剂的厂家较多，产品便于储藏，易于购得。主要的问题在于因该制冷剂含有化学成分，故在释放降解的时候有可能会引起环境保护方面的问题。比如，技术人员在切片时喷雾操作不当而不小心被动吸入制冷剂。
1.2固定组织的冷冻切片
一般来说，新鲜组织冷冻切片适合于大多数实验室的诊断需要。但是，由于新鲜组织有时容易引起某些易变化成分的扩散，这一情况在切片时比较明显。因为切片时摩擦组织产生热量，会引起组织的临时轻度融化。虽然这一情况对诊断影响不大，但是，有可能影响诸如酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。为了防止水解酶和其他一些组织抗原扩散，需要预先固定组织，使其能够局限[1]。具体方法：固定新鲜组织于甲醛钙，4℃，18h，流水冲洗，或蒸馏水短时过一下。若组织较少，容易破碎，如肠镜活检组织，吸水纸吸干。组织放入蔗糖胶液中4℃，18h。极小组织可以酌情缩短时间。固定组织块于组织托上方。蔗糖胶的配方：阿拉伯胶2g，蔗糖60g，蒸馏水ml，4℃保存。
2、冷冻切片的温度
2.1组织的适宜温度
冷冻切片的原理，是冷冻使组织变硬。冷冻组织中水分主要起像石蜡的浸蜡填充作用，冷冻的组织在切片前一般还需要用OCT等包埋剂包埋。但是，由于各种不同组织的形态结构和组成成分不同及所含水分多少不一致，故冷冻和切片所要求的适宜温度也就不同。如含水分较多的疏松组织就容易冻结，而含脂肪较多的组织就比较难以冻结。在同样条件下，前者冷冻快，后者冷冻慢。要在相同时间内冷冻好，给后者的温度就必须比前者低。判断和掌握各种不同组织切片的适宜温度和其他有关条件，只能不断积累实践经验。即或用现代化的低温恒冷箱冷冻切片机，仍然需要掌握丰富的经验和熟练的技术。实践经验告诉我们，当组织的温度在-45℃以下时，组织变为酥脆，不能正常切片，切出的片子破碎甚至呈粉末状。当组织的温度在-40℃～-30℃之间，虽然能切出片子，但切片时阻力大，并且常有碎片。组织温度在-25℃～-10℃时可以进行切片，并能切出较薄的连续切片。当组织温度升高到-5℃以上时，切片易卷曲甚至呈黏稠状而不能切成片。需要指出的是：这里讨论的冷冻切片时组织的适宜温度，不等于冷冻组织的适宜温度。即大部分组织冷冻时为了减少与缩小冰晶的有害影响，应在-50℃甚至更低的温度下迅速冷冻才好，而切片时需要待组织温度回升到-25℃～-10℃时才适宜。
2.2切片刀的适宜温度
切片刀的最适宜温度为-50℃左右。虽然对大多数组织和一般情况来说，切片刀的温度在-20℃左右就能得到比较满意的效果。但是有时为了制出更薄的连续切片，有必要使切片刀的温度降到-30℃～-50℃。使用效果好的半导体致冷或在低温恒冷箱冷冻切片机箱内用干冰致冷，可以达到这一要求。切片刀的适宜温度很低，是因为切片时组织块与切片刀之间的摩擦会产生热。可以设想切片时所产生的热会积留在切片刀口上，切片刀口的温度上升，使处在切片刀口两面的组织切面和已切出的片子温度升高，甚至使切片出现暂时的融化。当切片刀的温度很低时，则融化的厚度就变薄面积减少，被暂时融化的组织切片沿着很冷的切片刀面移下时，又很快重新冻结。因此，把切片刀的温度降至很低，对有切薄片需求的情况来说是有帮助作用的。
2.3环境的适宜温度
这里所说环境的适宜温度，一是指低温恒冷箱切片机箱内的微小环境，二是指有条件可利用的外部自然环境。低温恒冷冷冻切片机箱内的温度，一般来说，以-5℃～-10℃为适宜。但大多数低温恒冷箱冷冻切片机箱内的实际工作温度都低于这个水平，而常调节在-20℃左右[4-6]。这是由于切片刀的温度较所要求的适宜温度偏高，因而需要如此。组织、切片刀和环境的适宜温度虽然各不相同，而且差异很大，但是三者又是有联系的，要根据具体情况灵活掌握。一般来说，如切片刀的温度较高，则组织的温度就必须较低，环境的温度也相应低些。若组织的温度在适宜温度范围内偏高，则切片刀的适宜温度需偏低。
3、冷冻切片的冷冻与冰晶
制作冷冻切片，无论采用何种方法和设备，都要求组织的冷冻温度低，速度快。这样可以使有害的冰晶缩小甚至无明显影响[1，2]。未固定的新鲜组织在低温下迅速冷冻，即所说的骤冷，主要目的是尽可能缩小冰晶，以保持组织原来结构，减少酶活性的丧失，防止酶和其他物质的扩散以及蛋白（抗原、抗体）的变性等。要做到完全控制冰晶的形成，目前很难办到。即使在-℃的低温下使组织迅速冷冻，并进行低温真空干燥，电镜下在细胞质内特别是细胞间隙内仍可见未结合的水形成微小的冰结晶。普通冷冻切片，最低温度只能降到-45℃～-50℃，要想完全消除冰晶是根本不可能，只能力求冰晶体积缩小，不致影响观察。粗大的冰晶挤压周围组织，可以改变甚至破坏原有形态结构。当冰晶融化后，则在镜下可见到原组织形态结构被挤压变形，留下大小不一形状不定的空隙。关于冰晶形成的机制，有人提出，在一定体积的固化液体中，冰结晶的形成与结晶核的数目成正比，而与晶体形成的速度成反比。这就是说，要使冰结晶的体积变小，就要有很多的结晶核，而形成的速度要慢。结晶核分为均匀的和不均匀的两种。多而均匀的结晶核只能出现在很冷的情况下，大而不均匀的则常见于温度不够低的情况下。目前对冰晶形成的许多因素尚不能完全控制，在实际应用中主要是利用较低的温度使组织迅速冷冻，使结晶核形成既快又多，即达到都是均匀的结晶核，就可使冰晶体积变小。其次是创造条件，尽量采取新鲜组织直接冷冻，避免在取材、固定和冷冻时组织里混进水分，这样做对于减少冰晶和使冰结晶体积缩小都是很有益处的。
4、低温恒冷箱冷冻切片技术
自年第一台箱式低温恒冷切片机诞生以来，极大的方便了技术人员的切片操作和工作安全[1]。低温恒冷箱冷冻切片机实际上是一个特殊的冰箱或冰柜，内带一个特殊的切片机，所有的控制切片操作的部件都在柜外。随着病理技术的不断进步，各种先进的低温恒冷箱冷冻切片机层出不穷，虽然它们的品牌和型号各不相同，但是大多数切片机都具备以下优越的性能：电子温控；电子控制组织块的进退；组织包埋方向准确定位；数字显示温度；机械控制切片速度和厚度；配备自动化霜装置；配备自动防污染和自动消毒装置。制作薄的、高质量的冷冻切片，与组织的准备和低温恒冷箱切片机的性能有很大的关系。质量最好的冷冻切片易于从未固定的迅速冷冻的组织中获得。在恒冷箱中的冷冻组织，因为处理的过程比其它冷冻切片的方法相对较慢，可能会产生冷冻的人为改变。
5、与冷冻切片技术相关的问题
冷冻切片技术需要不断的实践进行掌握。切片的速度，组织的类型，组织块的温度，低温恒冷箱冷冻切片机等因素承担了与冷冻切片有关的重要角色。遇到冷冻切片的故障，首先应该参照冷冻切片机使用保养手册进行对症处理。平时最好将切片中遇到的常见问题列举成表，摆放在机器附近方便操作人员查阅使用。只有锋利的刀口，才能得到优质的冷冻切片。虽然不锈钢刀已日渐被一次性使用的刀片取代，但是因组织类型或处理方式的原因，在一些临床病理实验室、科研院校和动物实验室等单位，仍有使用不锈钢刀的情况，故磨刀技术也应该顺便掌握。一次性使用的刀片，因其具有持续可得的优质刀刃、特别容易冷却等优点，已被大多数实验室采用，只是在实际工作中对特别坚硬或致密的组织有所不适。抗卷板是装在冷冻切片机前部的，通常是用有机玻璃或硬质塑料制成的片状设置，主要用于切片时防止冷冻切片向上自然翻卷[1，5]。可以根据刀片或刀刃的角度需要调节抗卷板的高度，通过微调抗卷板的高度能够决定切片是否正常。抗卷板的微调方法是：首先保证抗卷板边缘不能有刻痕或破损。然后选择合适的箱体内的温度，选择合适的刀的角度，选择相对于刀刃的合适高度即可。切片后切片停留在刀背上，传统的做法是，取室温下的载玻片黏附（贴裱）切片。现在新型的低温恒冷冷冻切片机配有电子负压抽吸装置，能够有效地帮助吸附切片，便于载玻片黏附。另外，为防止切片在后面的染色中脱落，可用涂胶片黏附切片。涂胶剂有明胶-甲醛液，或多聚赖氨酸（浓度%）。明胶-甲醛混合液配方：1%明胶5ml;2%甲醛5ml。制作方法：置载玻片于上述混合液中，37℃干燥1h，或空气中过夜后收藏。多聚赖氨酸液配方：%多聚赖氨酸液。%多聚赖氨酸液制作方法：载玻片在此溶液中浸泡30min。流水冲洗约30min。蒸馏水冲洗，5min×2。95%乙醇洗，5min×2。空气干燥载玻片10min。载玻璃片两面均匀涂抹20μl多聚赖氨酸。空气干燥存放于干燥无尘处备用。
6、冷冻切片的注意事项
冷冻切片技术在组织学实验室，已广泛应用于手术中病人的快速病理诊断；酶组织化学的研究和诊断；免疫荧光技术；免疫组织化学技术；非酶类物质的判别和研究，如脂肪和某些碳水化合物；神经病理的研究等等[4，5]。冷冻切片最大的用途是为外科学手术中快速活检病理诊断提供有力的帮助。病理医生取材，组织标本经过冷冻等一系列的处理得到切片后，随即浸入95%乙醇，或冷丙酮固定，再经快速苏木精染色、氨水返蓝、伊红染色等处理，由此，快速病理诊断才能圆满完成。在实际操作中，应高度重视把握以下注意事项。
6.1组织取材应规范
用于冷冻切片的组织，大小要合适，厚薄要均匀。组织块的大小一般为cm×cm×cm～cm×cm×cm[6]。组织过大，切片的阻力过大，易产生皱折，刀痕，造成组织崩解，增加切片难度，影响病理诊断。反之，组织过小，破碎，则不宜将组织包埋在同一个水平面，影响切片操作，造成漏诊或误诊。
6.2组织标识要明确
重点部位的组织应该标识明确，明确组织的包埋方向。可疑肿瘤的范围，淋巴结和带有包膜的组织，需要将整个切面暴露且含有整个包膜的存在。对于条索状的组织要确定是否为切缘。
6.3组织结构要知晓
纤维结缔组织丰富的组织，如果逆着纤维纹理切片，容易崩裂。脆硬的组织应该主张薄切。脑组织易脱片且含水分较多，需要提前用滤纸拭干并准备防脱涂胶片。
6.4组织定位要规范
囊壁类组织需要竖立包埋，且切面含有整个组织面的全层，一般可以将几条立埋的囊壁排列在一起卷成“U字型”，可以帮助囊壁更好保持侧立。组织大小差异较大的，应该先包埋大块组织，并依靠大块组织摆放小块组织，这样可以最快的切到大小不同组织的最大面。细小的组织在包埋时，需要将底部垫高，防止因为切不到造成切片机损坏。包埋时可以选择先制作一个OCT冻托，在OCT接近凝固时，将组织快速“种植”包埋进半凝的OCT中。脑组织和脂肪组织应特殊对待。
6.5切片固定要及时
固定及时是冷冻切片制作的第一要素，固定的最佳时机应在切片后马上将裱好组织切片的载玻片放进固定液中固定。固定液要保持新鲜，经常更换。
6.6固定选择要准确
甲醇固定时间快，细胞收缩小，对细胞核和抗原保存较好。缺点是挥发性强，毒性较大。95%乙醇是兼有脱水作用的固定液，渗透力弱，固定速度慢，对糖原蛋白固定效果较好，能溶解脂类，易造成组织细胞收缩。丙酮能使蛋白沉淀，渗透力强，细胞收缩严重，对细胞核固定相对较强，对酶的固定较好，作用相当于乙醇，对糖原没有固定作用。AF液是乙醇和甲醛液混合的固定液，兼有乙醇和甲醛液的作用，固定的同时有脱水的作用。AAF液与AF液固定液作用相似，固定同时有脱水作用。因其中多了冰醋酸成分，故能迅速固定染色质，且固定效果均匀，还能抵消一部分乙醇对组织的收缩作用。
参考文献：
[1] BancroftJD.Theoryandpracticeofhistologicaltechniques[M].London:ChurchillLivingstone，8:98-.
[2] CarsonFL.Histotechnology.Aself2instructionaltext[M].Chica2go:AmericanSocietyofClinicalPathologistsPress，9:64-5.
[3] ProphetEB.Armedforcesinstituteofpathology.Laboratorymeth2odsinhistotechnology[M].WashingtonDC:ARP，:67-70.
[4] 王伯，李玉松，黄高等。病理学技术[M].北京：人民卫生出版社，0:88-9.
[5] 仲剑平。医疗护理技术操作常规[M].北京：人民卫生出版社，3:-9.
[6] 中华医学会。病理学分册。临床技术操作规范[M].北京：人民军医出版社，4:10-2.
赞赏
转载请注明：http://www.chengfangbj.com/ssxg/3698.html
