革命性突破第一次,冷冻电镜看见单个原子

年，诺贝尔化学奖授予JacquesDubochet,JoachimFrank和RichardHenderson三位科学家，以表彰他们在冷冻电镜领域的贡献。冷冻电镜使得高分辨率观测蛋白质等活性生物大分子结构成为可能，为结构生物学迎来了一个崭新的时代。

年以来，冷冻电镜一直在寻找突破，以摆脱X-射线晶体学，成为结构生物学领域的绝对霸主。但是，它还存在一个关键问题悬而未决：分辨率不够高！

5月22日，两个实验室在bioRxiv预印本同时发表文章，报道了一项革命性的突破：第一次看见蛋白质中的单个原子。

这一研究表明，冷冻电镜打破了一个关键的障碍，它将使人们能够以前所未有的分辨率来探索蛋白质的工作原理，这是其他成像技术（例如X射线晶体学）无法轻易实现的。这一研究巩固了冷冻电镜在绘制蛋白质3D形状图谱中的主导工具地位，并将帮助研究人员了解蛋白质如何在健康和疾病中起作用，并促使产生更好的和更少副作用的药物。

两篇文章分别来自德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜学家HolgerStark团队，和英国剑桥分子生物学医学研究委员会实验室(MRC-LMB)的结构生物学家SjorsScheres和RaduAricescu领导的团队。

HolgerStark说：“这是一个里程碑，突破最后一道分辨率屏障，真的没有什么可以打破了。”

加拿大多伦多大学结构生物学家JohnRubinstein也盛赞：“这是真正的‘原子分辨率’，真正是一个里程碑。”

蛋白质Apoferritin的冷冻电镜图。

图片来源：PaulEmsley/MRCLaboratoryofMolecularBiology

突破界限

冷冻电镜的发展已有数十年历史，它通过在电子样品上发射电子并记录所得图像来确定其形状。探测反弹电子的技术和图像分析软件的进步催生了一场始于年左右的“分辨率革命”。这使得蛋白质结构比以往任何时候都更清晰，几乎与X射线晶体学获得的结构一样好，X射线晶体学是一种更古老的技术，当蛋白质晶体受到X射线轰击时，它会从蛋白质晶体的衍射图案中推断出结构。

随着硬件和软件进步，虽然冷冻电镜结构分辨率得到进一步提高。但是科学家们在很大程度上依赖于X射线晶体学来获得原子分辨率的结构。这就产生了一个关键问题：研究人员可能要花费数月至数年的时间才能使蛋白质结晶，此外，许多医学上重要的蛋白质也无法形成有用的晶体。相比之下，冷冻电子显微镜只需要蛋白质在纯化溶液中即可。

原子分辨率图的精确度足以精确识别蛋白质中单个原子的位置，分辨率约为1.2?（1.2′10-10m）。这些结构对于了解酶的作用方式以及利用这些见解来识别可阻断其活性的药物特别有用。

为了推动冷冻电镜达到原子分辨率，两个团队致力于一种名为脱铁铁蛋白（apoferritin）的储铁蛋白质的研究。由于其岩石般的稳定性，这种蛋白质已经成为冷冻电镜的专属实验样品：之前的纪录是分辨率为1.54?的蛋白质结构。

然后，研究小组利用技术改进，拍摄了更清晰的脱铁铁蛋白照片。Stark的研究小组得到了这种蛋白质1.25?的结构，他们通过一种巧妙的装置，可以确保电子在撞击样本前以相似的速度移动，从而提高了最终图像的分辨率。Scheres、Aricescu和他们的团队使用了一种不同的技术来发射以相似速度移动的电子，此外，他们还发明了一种新技术，可以减少一些电子在离开蛋白质样本后产生的噪音，以及一种更灵敏的电子检测摄像头。Scheres说：蛋白质的1.2?的结构如此完整，以至于他们可以分辨出蛋白质和周围水分子中的单个氢原子。

Stark认为，将这些技术融合在一起可以将分辨率提高到1?左右，但低于1?，冷冻电镜几乎是不可能实现的。

更清晰的观测

Scheres和Aricescu还验证了一种名为GABAA受体的蛋白质。这种蛋白质位于神经元的膜上，是全身麻醉剂、焦虑药物和许多其他药物的靶标。去年，Aricescu的团队使用冷冻电镜将这种蛋白质定位到2.5?。使用新方法后，研究人员获得了1.7?的分辨率，甚至在蛋白质的某些关键部位也获得了更高的分辨率。“这就像剥掉了你眼睛上一层模糊的东西。”Aricescu说，“在这个层次的分辨率下，分辨率每提高半个?，就会打开一个新的宇宙。”

这种结构揭示了蛋白质中前所未有的细节，包括一种叫做组胺的化学物质所在的口袋里的水分子。“这是基于结构进行药物设计的金矿，”Aricescu说，因为它展示了药物如何取代水分子的机理，从而潜在地减少了药物的副作用。

Scheres说，GABAA的原子分辨率图并不像脱铁铁蛋白那样稳定，这将是一个挑战。我不认为这是不可能的，但这是非常不现实的，因为需要收集大量的数据。但是其他的改进，特别是在如何制备蛋白质样品方面，可能会为GABAA和其他生物医学重要蛋白质的原子分辨率结构铺平道路。蛋白质溶液被冻结在由黄金制成的小网格上，这些网格可以使蛋白质保持更稳定。

“每个人都对MRC-LMB和Max-Planck团队所展示的令人震惊的分辨率水平感到非常兴奋和惊讶，”东京大学冷冻电镜专家RadostinDanev说。但他也认为，对于更不稳定的蛋白质来说，样品制备是该领域的主要挑战。他说：“一段时间内，只有表现良好的样品才能获得低于1.5?或2?的分辨率性能。”。

Scheres说，这些突破可能会巩固冷冻电镜作为大多数结构研究的首选工具的地位，渴望原子分辨率结构的制药公司可能更倾向于使用冷冻电镜。但Stark认为X射线晶体学仍然有一定的吸引力。如果一种蛋白质能够结晶，那么在很短的时间内将其结构与成千上万种潜在药物结合是相对有效的。但是，要生成足够的数据以用于超高分辨率的冷冻电子显微镜结构，仍需要花费数小时甚至数天的时间。

Stark认为：“每种技术仍然有优缺点，有人说，冷冻电镜基于这些最新突破性进展将完全取代X射线晶体学，我对此表示怀疑。”

参考文献：

“Itopensupawholenewuniverse”:Revolutionarymicroscopytechniqueseesindividualatomsforfirsttime.Nature,.

DOI:10./d---1

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