为啥冷冻电镜技术得诺奖这个杀手级技

最近cryo-EM的进展让研究人员能够在近原子分辨率上确定蛋白结构,从而极大地扩展了这种技术的生物学适应性。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)真算不上是一个迷人的蛋白,早在几十年前,它的结构便已被X-射线晶体衍射技术(X-raycrystallography)确定了。β-半乳糖苷酶被人熟知的生物化学特性让它成为被人们广泛使用的基因表达实验监测因子。然而谁都没想到,年6月,这个“踏实干活”的酶却成为了结构生物学领域的超级明星。通过精心优化他们的单颗粒cryo-EM技术,美国国立癌症研究所(USNationalCancerInstitute)的SriramSubramaniam等人以平均2.2?的空间分辨率解析了β半乳糖苷酶。这个分辨率属于近原子水平,并且曾一度被看做X-射线晶体衍射技术的专属分辨率。Subramaniam等人的成果使研究人员得以放大α-螺旋和氨基酸侧链,从而仔细观察水分子,甚至单个的离子。

据Subramaniam回忆,在这项研究前的几个月,他的一位同事在与他书信往来时直截了当地告诉Subramaniam,要达到这种分辨率是不可能的。这位同事很早就认定,单颗粒cryo-EM技术的分辨率只能达到3?,不可能再提高了。现在Cryo-EM的先驱者已经成功地往前迈进了一大步,可以研究更细小、更活跃的蛋白,这只是过去几年里,证明那些反对声音是错误的新兴技术取得的一系列胜利中的一个。虽然目前X-射线晶体衍射技术仍然是结构生物学领域不可动摇的首选技术,但是越来越多的研究人员已经被采用cryo-EM能在原子或近原子分辨率水平解析单个蛋白分子结构的应用前景所吸引,因为这种技术无需像晶体衍射技术那样,需要改进或掌握非常繁琐的操作以探索蛋白复杂的机制。

打破僵局

DorothyHodgkin因开发了蛋白晶体衍射技术而获得了年的诺贝尔化学奖。到了20世纪60年代末,该技术渐趋完善,这让某些年轻的结构生物学家渴望新技术的出现。哥伦比亚大学(ColumbiaUniversity)的研究员JoachimFrank表示,这项技术已没有任何挑战可言,他可不想继续钻研了。

EM的分辨率达到原子级别,可用于解析3D结构,它是晶体衍射技术的一种前景光明、但是未经验证的替代方法。英国剑桥医学研究委员会分子生物学实验室(MedicalResearchCouncilLaboratoryofMolecularBiology,MRCLMB)的DavidDeRosier和AaronKlug于年用一张噬菌体尾部EM照片首次对EM进行了验证。然而,用于获取生物样品高信噪比图像的样品制备技术(脱水和使用重金属进行染色处理)却导致图像失真,模糊了图像中分子的细节。

欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory,EMBL)的JacquesDubochet根据劳伦斯—伯克利实验室(LawrenceBerkeleyLaboratory)的KennethTaylor和RobertGlaeser设计的方法,开发出一款新技术。该技术在一块很薄的玻璃化冰膜上冻结仍处于天然、水合状态的样品。这种比冰晶还要透明的玻璃化冰膜可以减少图像伪影。自此,cryo-EM领域诞生了。据该领域另一位先驱,来自MRCLMB的RichardHenderson回忆,年时他安排了一位学生去听Dubochet的课。这名学生学成归来时告诉Henderson,cryo-EM技术才是未来所在。

最早期的3D结构是由多个对称或高度有序结构,例如病毒粒子的2D图像组装而成的。如果想要获取不对称的结构图像,就需要重新借助晶体衍射技术了。在晶体衍射技术中,高度有序的2D晶体可以将目标蛋白锁定在特定的取向,这样便可拍摄出目标蛋白不同角度的图像。年,在电子晶体衍射技术的帮助下,Henderson等人采用EM首次以原子分辨率解析了蛋白结构,这个蛋白就是光响应蛋白细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)。然而,相较于X-射线晶体衍射技术,电子晶体衍射技术的优势并不十分明显。马克斯普朗克生物物理研究所(MaxPlanckInstituteofBiophysics)的WernerKühlbrandt指出,对电子晶体衍射技术来说,比起获取高质量的膜蛋白的3D晶体,要获取高质量的该蛋白的2D晶体并不是一件容易的事,甚至还有一定难度。

20世纪70年代中期,在剑桥大学(UniversityofCambridge)任职博士后研究员的Frank试图越过晶体,仅仅依靠由大量单个分子组成的分子群来获取高分辨率的蛋白结构。Frank承认自己的想法有点疯狂,因为当时的行业共识就是你必须要保留有序晶体这一步。Frank的做法是不直接解决无序单颗粒的异质性问题,转而通过捕获大量随机分布的颗粒的2D投影来解决这个问题,随后采用算法来对这些投影进行分类,最后将它们组装成3D图像。Frank等人于年发表了他们首个核糖体单颗粒cryo-EM结构;不到10年,他们又取得了新进展,以接近10?的分辨率解析了该蛋白结构。

尽管如此,在接下来的20多年里,该领域仍然笼罩在晶体衍射技术的阴影下,因为这段时间内,晶体衍射技术一直在解析膜蛋白结构方面不懈努力,最终让人们得以仔细观察蛋白细节,而单颗粒cryo-EM的研究人员则仍在费劲地解析相对较大的蛋白结构域。珍利亚研究园区(JaneliaResearchCampus)NikolausGrigorieff表示,许多人都质疑cryo-EM的合理性,同时调侃这种技术为“一团浆糊学(blob-ology)”。

超越“浆糊学”

既要获取结构细节,又不想破坏脆弱的样品,这真是一个两难的抉择。低电子量不会破坏蛋白样品,但这样只能获得低信噪比的噪声图像。直到几年前,cryo-EM的研究人员仍然只能费力地使用照相感光胶片获取这些图像,或牺牲灵敏度,借助电荷耦合器件(chargecoupleddevice,CCD)摄像机实现自动检测功能。

直到可以直接响应单个电子的、灵敏度非常高的检测器出现,cryo-EM研究领域才发生了翻天覆地的变化。其中一种由一个欧洲协会和Henderson联合开发的“直接电子探测器”的研究基础就是一款粒子物理学原型。据Henderson回忆,只要将这个探测器放进他们的显微镜里,就立即可以看到单个电子,并且能判断这个电子是否运作良好。随后,这款探测器被FEI商品化,同时,DirectElectron公司和加州大学圣地亚哥分校(UniversityofCaliforniaatSanDiego)的研究人员MarkEllisman和NguyenHuuXuong共同开发了一款相似的探测器。灵敏度的提高表明了该技术发生了重大飞跃。MRCLMB的研究人员SjorsScheres表示,将这款检测器与CCD结合起来,他们就可以抛弃90%的电子了,现在每两个电子就有1个能被他们检测到。在某些情况下,检测效率甚至可以达到80%。

第三款检测器由Gatan公司、劳伦斯—伯克利实验室(LawrenceBerkeleyLaboratory)的PeterDennis以及加利福尼亚大学三藩分校(UniversityofCaliforniaatSanFrancisco,UCSF)的DavidAgard联合开发。这款检测器具有另一种优势。虽然所有的直接探测器都可以在测量周期内捕获追踪电子信号的多帧电影图片,但是Gatan公司的K2还能计算电子的数目,而不是仅仅记录它们。这个特点对捕获细小蛋白的低分辨率结构信息非常有帮助,因为这些信息很容易融入背景而消失不见。位于纽约结构生物学中心的美国国家自动分子显微技术资源网(USNationalResourceforAutomatedMolecularMicroscopy,NRAMM)的BridgetCarragher指出,如果在那些频率上没有良好的信号,那么你就有可能看不到那个颗粒、无法将它从旁边的颗粒中区分出来,或无法确定它的取向。

这些检测器对cryo-EM研究领域的直接影响离不开经过长期演变、与它并行发展起来的算法。Carragher指出,如果你很努力地利用软件开展研究工作,但是硬件又跟不上,那就是徒劳。但是,如果硬件技术取得突破进展,那么软件的作用就可以超常发挥。年,耶鲁大学(YaleUniversity)的研究人员FredSigworth提出了一个基于最大似然法(Maximumlikelihood)的EM数据解析策略,即采用与“母结构(parentstructure)”相关的取向概率来对每张2DEM图像进行分类。作为马德里国家生物技术中心(CentroNacionaldeBiotecnologíainMadrid)Jose-MariaCarazo’s小组里的一名博士后,Scheres一直致力于扩展这种方法,以重建3D蛋白结构,通过这种研究策略,他们可以开展所谓的无监督分类法(unsupervisedclassification)。Scheres指出,他们的实验还表明,无需提前了解结构间的实际差异,便可将所有数据划分为不同的结构状态。现在,Scheres的这种方法已然成为被人们广泛使用的图像分类算法的基础。

不得不提的是智能软件,因为它帮助我们解决了另一个cryo-EM问题:电子束释放的能量导致的蛋白运动,这种运动会降低图像的分辨率。在采用直接电子检测器原型开展研究工作后,Grigorieff提出了一个新算法,也即利用视频数据格式来解析颗粒的运动情况。现在这种方法已经成为了单颗粒cryo-EM技术的常规方法。Grigorieff表示,这种策略不但有助于我们比对多帧电影图片,还能消除可能会发生的图像模糊现象。他还引用另一位实现这些分析技术飞跃发展的无名英雄的话:获取低成本,但强大的处理能力。你可能不相信,但是促进这种飞跃的原因竟是游戏产业,因为这个产业使消费级别的电脑可以处理越来越大的数据集。年时只有最大的数据中心才能进行的数据处理工作,到年人们在家里的个人电脑上便可实现。

运动的蛋白颗粒

Cryo-EM技术取得的进展极大地鼓舞了该领域的研究人员。随着直接电子检测器在年投放市场,cryo-EM技术便开始以惊人的速度取得一次又一次的成功。核糖体是一个大型而又为人熟知的结构,同时它也是cryo-EM领域的重要的基础研究项目。早期对核糖体的研究已经显示出cryo-EM技术的强大威力。研究人员并非简单地将数以百万计的颗粒拼凑成10?的结构,而是通过研究不到个颗粒,直接以近原子分辨率解析蛋白。MRCLMB的Scheres和VenkiRamakrishnan共同工作,最终解析了分辨率为3.2?的酵母线粒体核糖体(yeastmitochondrialribosome)大亚基结构;不到一年,Scheres又在人类整个线粒体核糖体上做出了类似的壮举。

研究人员发现高分辨率的cryo-EM最适合用于研究大型的蛋白质,但是小型蛋白呢?有人质疑信噪比的降低和更频繁的蛋白运动造成的伪影是否会导致cryo-EM无法研究小型蛋白。UCSF的程亦凡是首位利用cryo-EM研究kDa以下蛋白的研究人员。他以原子分辨率解析了哺乳动物离子通道TRPV1的结构。随后,Scheres学会了辨别由电子束导致的看似不稳定的分子运动的不同模式。他表示,冰里的蛋白颗粒往往与它们旁边的颗粒有着同样的运动趋势,我们可以通过这些信息更好地预判它们的运动情况。这个发现让Scheres和清华大学的研究人员施一公一起得到了分辨率为3.4?的γ分泌酶复合物(γ-Secretase)的电镜结构。γ分泌酶复合物是一种阿尔茨海默病(Alzheimer)相关酶,它的蛋白量仅为kDa。对此,Kühlbrandt表示,这个成果真是让人难以置信。一年半前,Kühlbrandt从未想到居然能取得这种分子量大小的、蛋白分辨率如此高的电镜结构。

接下来,就是要解决分辨率限制的问题了。尽管大量的研究已证实cryo-EM的分辨率能够达到原子级别,但自从达到3?分辨率后,基本上就没有多少进一步的研究成果了。Subramaniam指出,直到去年12月,几乎每个人都认为cryo-EM有着不可逾越的限制。对此,他和他的研究人员并没有积极寻找新的解决方法,而是回顾他们以前对β-半乳糖苷(β-galactosidase)开展的研究,试图优化该技术。最终,他们的努力得到了回报,获得了前所未有的平均分辨率为2.2?的蛋白电镜结构。Subramaniam表示,他们系统地整理每一个步骤。Subramaniam还指出,之所以能取得这个成果,只不过是因为他们不去理会这种方法的限制,并且不断摸索条件。

由于cryo-EM能够统计大量的蛋白颗粒和捕获大群构象不同的蛋白颗粒,因此它在研究蛋白动力学方面有着独特的价值和意义。Frank的研究小组最近在原子水平上解析了延伸因子EF-G催化核糖体异位的机制。Frank指出,他们可以在样品中看到两个不同的结合位点。他认为他们现在可以试图解决过去想都不敢想的问题了。医院(HospitalforSickChildren)的JohnRubinstein小组同样使用cryo-EM来捕获7个不同构象的牛ATP酶。尽管分辨率没有达到原子级别,但是取得的电镜结构已经为重构这些酶的旋转机制提供了足够多的细节了。Rubinstein表示,他们试图观察这些分子的运动轨迹,然后打算以高分辨率解析它们的结构,从而探明这些分子是如何形成更加动态的结构的。

“成长的烦恼”

兴奋是具有传染性的,尤其是对沮丧的结构生物学家而言。Carazo指出,现在想投身于EM领域的研究人员简直呈爆炸式增长。这些研究人员手头上都有想要使其结晶的样品,或者曾经将样品交给晶体学家,但却没能从中获取有用的信息。

虽然这个领域慢慢火起来了,但质量控制问题却不得不重视。由于没有非常精准的验证方法,所以围绕数据解析有很多争议。其中一个最突出的例子就是1,4,5-三磷酸肌醇受体1(inositol1,4,5-trisphosphatereceptor1,IP3R1)。据Henderson回忆,年-年间共发表了三篇关于该受体的cryo-EM结构的文章。而且这些结构都是各不相同的!不过这些研究都是在直接电子检测器问世之前开展的,当时的技术分辨率很低,并且背景噪声很严重。一旦图像处理软件将噪声当做信号,那么后续任何更进一步的数据解析工作都会出现错误。Henderson和他在MRC的同事PeterRosenthal针对这个问题提出了解决方法——“tilt-pair验证(tilt-pairvalidation)”:收集同一个待检样品的两个不同取向的图像,随后分别处理不同取向的图像数据集,并对比两组数据,查看得出的比对结果能否反映已知的取向差异。Rubinstein指出,如果捕获的图像无法重现样品相对旋转关系,那么你的图像可能就是错的。现在,这个问题已经没那么严重了,因为我们可以在现代仪器中揭示精心准备的样品的清晰的二级结构了(即便不是氨基酸侧链),那么这将能大大简化数据解析工作。不过,值得注意的是,这个过程还不能完全自动化。Grigorieff指出,要是出了什么错误,软件可不会通知你。如果你只是使用软件工具而不考虑结果是否正确,你就有可能犯大错。

数据共享将会是防止和纠正错误的另11一种方法。年,欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute,EBI)构建了电子显微技术数据银行(ElectronMicroscopyDataBank,EMDB),研究人员可以往里面存放他们的3D图像数据,并且许多研究论文如果想要获得发表,就必须要有存放在EMDB的相关数据。生物物理学会(BiophysicalSociety)会长兼美国弗吉尼亚大学(UniversityofVirginia)研究人员的EdwardEgelman进一步号召研究人员在提交图像数据时,一并提交经过审稿人审阅的论文手稿,因为如果仅仅提供蛋白结构的图像是无法对其进行独立验证的。Rubinstein赞同Egelman的做法,还表示,但很多人担心这样会在论文发表前就泄露研究成果。另一边厢,EBI也构建了电子显微技术试验性图像档案库(ElectronMicroscopyPilotImageArchive,EMPIAR),研究人员可以以自愿为原则,存放原始数据——可用于验证新型分析算法的有价值的资源。

面对cryo-EM取得的成就,即便是经验丰富的研究人员,也会受其鼓舞,不畏艰难困阻地想要采用最前沿的电子显微镜。目前该领域的领军者是FEI的TitanKrios,这台显微镜身价不菲,竞达万美元,这可是许多研究机构都无法承受的价格,而且这个价格还没有算上维护和操作的费用呢。Grigorieff感概到,什么研究都没做,你每年就要花费接近50万美元了(指使用这台显微镜)。集中型设施也许是一个解决方法。在美国,一些机构,例如珍利亚研究园区和美国国家自动分子显微技术资源网就允许研究人员预约使用高端的仪器;而在欧洲,几个国家已经构建起国家级机构,例如英国的电子生物成像中心(electronBio-ImagingCentre,eBIC)和荷兰的纳米显微技术中心(CentreforElectronNanoscopy,NeCEN)。Krios显微镜的精密技术使它可以极大地提高数据采集速度,并可以预防出错,然而Carragher却不认为每个研究机构都必须配备Krios显微镜。她指出,只要大多数机构配有性能良好的中档设备,少数几个中心配置高端的仪器就是一个很好的解决方法。成本更低的仪器可以让我们初步了解蛋白结构,然后判断是否需要使用Krios获得进一步的信息,这样性价比更高,Carragher等人已经证明,通过巧妙地使用中档显微镜,就可以获得分辨率低至3.7?的电镜结构。

消除障碍

精简成像过程是当务之急,目前NRAMM正积极开发cryo-EM的自动化工具。Carragher指出,他们现在已落后于晶体学家,晶体学家可以将样品邮寄给光束线站,然后由机器人自动完成相关工作。Carragher还表示,现在落后没问题,但他无法想像到了某个时期他们还无法实现技术的完全自动化。目前NRAMM的研究人员已经开发出两款软件,即Leginon和Appion,它们可以部分实现图像收集和处理的自动化。然而,Cryo-EM领域内某些经验丰富的研究人员仍然不愿意太过依赖自动化。Rubinstein表示,目前完全自动化技术产生的数据非常多,但其中高质量的数据却不够多。

事实上,我们很容易就能获得大规模的数据量,因为使用者每天都能生产出百万兆字节的cryo-EM录像。鉴于目前硬盘的容量已经越来越大,数据储存倒不是问题,而数据处理才是问题所在,因为它有瓶颈期。Frank指出,即便现在我们已有功能强大的计算机集群系统,但是要处理大规模的数据,还是需要非常多的计算时间。此时,游戏产业也许能再次拔刀相助,因为该产业内的科研人员已经学会有效利用高端图像处理单元的强大功能了。“云技术”也可能是另一个选择。哈佛大学(HarvardUniversity)的MichaelCianfrocco和AndresLeschziner已通过采用Amazon的EC2商业基础设施成功将分析费用降低到1美元/蛋白。

CRISPER技术和高质量图像将有助于进一步减少构成最终结构图像的蛋白颗粒的数13量。年,Henderson通过计算得知,理论上每个人可以通过-个颗粒,而不是数百万个颗粒来解析原子分辨率结构,而这些年来的技术进步更加坚定了他的信心。Henderson认为,总有一天,我们将能通过-个颗粒来解析完整的结构。配备更加灵敏、无噪声的电子检测器是进行相关研究的必要条件。Scheres强调,要想打造几近完美的检测器就放手去做,其应该没有物理极限。Henderson等人目前正朝这个方向努力,同时他估计下一代检测器将会在未来几年内面世。改进样品制备技术也会有助于cryo-EM研究。自Dubochet开拓性地改进了样品制备技术以来,该技术就停滞不前了。当时Dubochet将蛋白样品放在一个取样载网上,然后用滤纸吸干多余的液体,随后他们将载网和样品一起冻结,以开展后续研究。某些研究小组一直致力于通过调整取样载网的材料,以进一步提高样品的稳定性,或者试图通过数量较少的蛋白来制备实验样品。而其他小组则开发出一款新型“相位板(phaseplate)”。这块板可以提高图像之间的信噪比。Carazo指出,对于较小的样品来说,这样可以使比对工作更方便易行。

如果能通过数目较小的颗粒取得质量较高的数据,那么将能极大拓宽cryo-EM的作用,这样,研究人员不仅能成像较小蛋白结构的更多细节,还能更有效地分析蛋白结构与功能之间的关系。Frank已经在往这个方向努力了,他目前正在采用时间分辨cryo-EM技术来捕获核糖体翻译过程中的稀少中间产物。Frank表示,他们确实已经发现了以前从来没有被观察到的转瞬即逝的状态。Grigorieff推测研究人员将很快就能完成对细胞蛋白质组的广泛的结构筛查工作。Grigorieff表示,过去,裂解细胞并对其成像,然后用软件技术在不同状态下重构不同的分子就是一个梦想而已,虽然现在还没能实现这个梦想,但也许这只是个技术问题,如果真的是技术问题,那么总有一天能实现。

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