突破冷冻电镜分辨率记录直视蛋白质的原子级

5月21日德国马普生物物理化学研究所的HolgerStark团队发表了研究论文《BreakingthenextCryo-EMresolutionbarrier–Atomicresolutiondeterminationofproteins!》他们团队实现了通过以原子级别的分辨率（1.25A）解析生物样品的结构，从而直接可视化蛋白质中的所有原子（包括氢原子）！蛋白质结构里原子位置的直接可视化押，对于研究理解蛋白质催化的化学反应机制、药物结合对蛋白质的干扰作用非常重要！

冷冻电子显微镜原理

通常在分辨率高于4A的条件下，建立蛋白质原子模型的可能性变得很高，但是要直接可视化蛋白质结构确定中的真实原子位置，则需要显着更高的分辨率（1.5A），而到目前为止，cryo-EM尚无法实现。在此之前，cryo-EM达到的最高分辨率，是针对高度对称的病毒，通常病毒体积要在几十纳米至几百纳米级别，所以病毒颗粒比蛋白酶体约大多倍，而观察分辨率单位1A级别的蛋白质原子结构细节更加困难（1埃=0.1纳米）。

冷冻电子显微镜A级别观察分辨率对比

原子位置的直接可视化对于理解蛋白质催化的化学反应机制以及研究药物结合和对蛋白质功能的干扰至关重要。在这里，我们报告了使用新开发的电子显微镜通过cryo-EM获得的脱氧铁蛋白的1.25A分辨率结构，该结构提供了前所未有的结构细节。我们的载铁蛋白结构的3D信息含量几乎是当前世界纪录重建的3D信息含量（分辨率为1.54A）。在cryo-EM中，我们第一次可以可视化蛋白质中的单个原子，查看氢原子的密度和单原子的化学修饰。除了名义上提高分辨率外，我们还可以显示出冷冻-EM密度图质量的显着改善，这与在基于结构的药物设计中使用冷冻-EM非常相关。我们使用了新开发的电子显微镜（TitanMono-BCOR）除了提高分辨率外，本研究还可以显著改善冷冻电镜密度图质量，获得了载铁蛋白的1.25A分辨率的分子结构，该结构揭示了以前从未看到的结构细节。在cryo-EM技术发展史上，这是第一次可以可视化蛋白质中的单个原子，并能够查看氢原子的密度和单原子的化学修饰。

冷冻电子显微镜（Cryo-EM）在解决高分子复合物的三维（3D）结构方面非常流行并取得了成功。电子显微镜硬件，图像处理软件和计算技术的改进是当今所谓的cryo-EM2分辨率革命的基础。近年来，在高分子复合物的高分辨率结构测定中出现了惊人的指数增长，并伴随着结构可达到的最高分辨率的不断变化。尽管大多数已解析的蛋白质结构仍处于3-4A分离度的状态，但现在越来越多的结构达到2-3A的范围，并且很少有样品的分辨率高于2A。该领域的当前记录是载铁蛋白1的1.54A分辨率结构（EMD-）。使用配备冷场发射枪电子源和能量过滤器的JeolCryoARM显微镜确定该结构3。获得越来越高的分辨率提出了有关单粒子冷冻EM极限分辨率极限的重要问题。我们可以将这项技术推到多远？在仪器方面有哪些限制因素？是否甚至需要更好的硬件，还是仅通过图像处理软件就能克服光学限制？我们的目标是通过以真实的原子分辨率解?决生物样品的结构，从而直接可视化蛋白质中的所有原子（包括氢原子）来解决这些问题。我们使用了配备有其他电子光学元件的原型仪器来提高电子显微镜的性能。单色仪4和第二代球差校正器5（CEOSGmbH）安装在配备Falcon3直接电子探测器的ThermofisherTitanKrios电子显微镜中。这种硬件组合既通过减少单色器导致的电子束能量散布，又通过像差校正器减少了像差，例如轴向和离轴彗差，从而改善了光学性能。作为参考，此处使用的显微镜??具有约0.1eV的能量散布，该能量散布比配备有Shottky场（≈0.7eV）或冷场发射电子源（≈0.4eV）的显微镜要小，从而显着提高了时间图像中高分辨率结构细节的一致性和较少的衰减（图1）。附加的BCOR球面像差校正器可提供无轴向和离轴彗差的图像，在1A分辨率下，这是最大的限制像差。此外，BCOR校正器可以校正高达五阶的像差，还可以用于使图像中的线性失真最小化，从而导致图像的放大倍率不均匀（补充图2f）。线性畸变总是存在于电子显微镜中，高端显微镜通常会遭受线性畸变的困扰，线性畸变的范围为0.5-1％。对于相对较小的样品，获得3A分辨率结构时，这些值可以忽略不计，但对于较大的高分子配合物和接近原子分辨率，则可能成为分辨率限制。在我们的显微镜中，典型的线性畸变可以最小化到0.1％，并在更长的显微镜操作时间下保持稳定。因此，从这种新显微镜获得的图像不需要像通常从标准电子显微镜获得的图像那样通过图像处理对线性失真或彗差进行后续校正。

由于生物物体对电子束的敏感性，它们在低电子剂量下成像，因此图像遭受大量噪声。为了解决这个问题，使用了数十万个甚至几百万个粒子图像的平均过程，通过图像处理来计算一个3D结构。可以通过实验B因子（由Henderson和Rosenthal7定义）来描述需要多少个此类粒子图像才能获得特定的分辨率。当绘制颗粒数的对数相对于分辨率的倒数平方时，颗粒数与分辨率之间的关系变为线性关系，并且从该曲线的斜率确定实验B因子。实验B因子代表给定电子显微镜的所有分辨率限制因子的摘要，并描述了仪器设置的整体质量。此外，假设专门的图像噪声是至关重要的，并且不存在其他分辨率限制因素，则B因子图可以推断需要多少颗粒才能达到更高的分辨率。载铁蛋白的高分辨率结构到目前为止，发表的2-3.5A蛋白质结构显示出与X射线晶体学类似的非常相似的特征，即使电子和X射线光子的散射本质上是不同的物理事件。但是，这在非常高分辨率的系统中有望改变。在X射线晶体学中，氢原子8中单个电子的有限光子散射能力有限，很难看到氢原子。低温电磁法的情况有所不同，因为电子被核电势散射，从而–在H原子的情况下会导致更大的散射截面9与X射线晶体学中的光子相比10。尽管H原子通常仅在接近1A或更高的分辨率下才能在X射线图中可见，但应该认为它们在低温EM中以较低的分辨率才可见。

载铁蛋白的真实原子拆分结构-一些结构细节，真正的原子分辨率：以1.25A分辨率可视化单个原子和氢。在高（红色网格）和低（灰色网格）密度阈值下显示了三个载铁蛋白残基。第一行通过高阈值下各个C，N和O原子的清晰分离显示了我们图的真实原子分辨率。第二行显示单个氨基酸侧链所有部分中氢原子的密度。氢原子的球形表示（黑色）包括在原子模型中。氢原子密度的相似可见性在X射线晶体学结构中需要约1?或更高的分辨率（补充图3）。第三行同时使用两个密度阈值显示了三种氨基酸的特写视图。为了达到去铁铁蛋白的高分辨率结构，我们记录了使用金网格（为1.2μm和1.2μm的孔），对应于0.的像素大小和每约40电子的总剂量的图像2，在一个猎鹰3检测器在电子计数模式（参见图1）。根据初始数据计算的B因子图表明，要获得1.3A的分辨率将需要超过万个脱铁铁蛋白颗粒图像，即由于氢原子之间的H原子横截面的差异而可能显示氢原子的分辨率上面讨论的光子和电子。的网格制备和成像条件的优化使我们能够越过1.5的分辨率屏障仅17.颗粒图像。使用总数为1..的粒子图像，我们最终获得了分辨率为1.25A的图像。

可视化单原子化学修饰：人脱铁铁蛋白的半胱氨酸90位于大分子复合物的表面。在cryo-EM中，通常在较低的局部分辨率下确定暴露于溶剂的区域，但在我们的高分辨率结构中，仍足以可视化单个原子的氧修饰（在整个分子上用正方形标记，在红色圆圈中用红色圆圈标记）特写当前可用的电子显微镜在最大分辨率方面有非常大的障碍，很难通过图像编号来克服。因此，改进电子显微镜硬件对于以极高的分辨率在冷冻EM电子显微镜中更定量地解析蛋白质结构至关重要。这项工作显示了朝这个方向迈出的重要一步，以前所未有的分辨率提供了蛋白质结构，从而可以研究原子细节。为了更常规地达到真正的原子分辨率和更高的通量，将需要对冷冻电磁技术进行进一步的开发，而在如此快速发展的领域中，这实际上是可以预期的。下一代电子显微镜和检测器有可能为我们对蛋白质催化机制的理解，以及基于蛋白质的高分辨率和高质量3D结构，和各种新药物的研发做出重大贡献。

与迄今为止报道的1.分辨率的最高分辨率图（EMDB-）相比，我们的冷冻EM图在1.55/1.25cry分辨率下的结构特征：在三个冷冻-EM图谱中，在两个不同的密度阈值下显示了三个载铁蛋白残基（His，Phe51，Arg76）。第一行显示了我们目前在1.25A分辨率下的高分辨率地图，第三行显示了从1.55A分辨率下从同一数据的较小子集获得的结构。此重建仅需要17.个粒子即可获得1/3的分辨率，这比1.54英寸JeolCryoARM图（第二行）低6.7倍。低阈值密度网格始终以灰色显示，并且相应的原子模型中包含H原子（白色棒）。仅在KriosMono/Bcor结构中，分辨率为1.25to才能容纳所有氢原子。在较高的阈值下，两个结构分别为1.54A和1。

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