第17期不同类型冷冻保护剂对精子的影响

作者：宋双（硕士一年级）

导师：曾申明教授

课程：动物生殖生理学

主讲老师：刘国世教授

配子和胚胎冷冻技术目前已发展成为辅助生殖技术的重要手段，极大的推动了体外受精、胚胎移植等生殖技术的发展。尽管冷冻技术在现阶段被看作是辅助生殖最基础的程序，但是低温生物学实际上是一个非常复杂的学科，例如在冷冻保存的过程中，精子可能会因为缺少内部保护机制、形成冰晶、细胞破裂等死亡。冷冻保存是否成功，要看它们在解冻以后的发育状况，以及能否产出存活的后代。冷冻过程中需要考虑多方面的因素，其中冷冻保护剂对冷冻保存的成功起到了重要作用。它们对细胞的保护方式很大程度上取决于特定化合物是否能够渗透进入细胞。因此，冷冻保护剂主要分为两类：渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，本文介绍了这两类保护剂中常用的试剂对精子造成影响，探讨如何在保证其冷冻保护效果的同时尽可能的降低冷冻保护剂的毒性影响。

关键词：冷冻损害，渗透性冷冻保护剂，非渗透性冷冻保护剂，毒性

自20世纪70年代小鼠胚胎冷冻保存成功以来，配子和胚胎冷冻技术目前已经广泛的运用到繁殖领域中，不仅极大的提高了家禽的繁殖力，同时也推动了基因库的构建和人类辅助生殖技术的发展[1]。冷冻保存是通过冷冻保护剂和一定的降温措施，使得活的细胞或组织可以在超低温环境下长期保存。但是在冷冻过程中，由于冰晶的形成、冷冻保护剂浓度过高使得渗透压剧烈变化以及保护剂本身的毒性等因素会对细胞造成冷冻损害，影响冷冻细胞在解冻以后的存活。关于低温保存对细胞造成的冷冻损害，一般认为有对细胞骨架造成的损伤和对细胞器造成的损伤。细胞骨架是一种超微网络结构，由蛋白质纤维组成，它贯穿细胞，用于支持、运输和运动。细胞骨架是低温保存过程中损伤的靶点，作为动物细胞中三种细胞骨架之一的肌动蛋白，高度集中在质膜下，对质膜的任何机械损伤都可能会破坏肌动蛋白。在冷却条件下，质膜可能是冷冻损伤的主要部位，质膜提供了细胞内外环境之间的物理分离，对质膜的损伤将导致质膜功能固有的屏障、门控和信号传递过程的中断[2]。受损的质膜和随后的半渗透性丧失是细胞致命损伤的指标[2]。两种最常被考虑的低温损伤类型是冰晶对细胞膜的直接或间接损伤和冰晶周围未冻结部分的高溶质浓度影响，这可能导致细胞蛋白变性或脂质双层膜损伤，此外，脂质双分子层膜本身在冷却时会发生相变和结构变化[2]。其次，细胞间质内含水分较多，组织疏松，密度较低，冰晶极易在细胞间质中形成冰晶，在疏松的细胞间质中滞留后，对细胞间质造成损伤。细胞间质受损后，线粒体开始受损，首先是线粒体嵴被破坏，嵴消溶[2]。糖、脂肪和蛋白质在各自的分解代谢过程中，最终都有水形成，使线粒体内含有较多的水分，因而当冷冻速率下降后，冰晶极易在线粒体内形成，对嵴产生挤压损伤，最终可能会导致线粒体功能衰竭[2]。

图1：冷冻对精子的损伤

冷冻方法目前通常分为慢速冷冻、快速冷冻和玻璃化冷冻。如图2，如果细胞冷冻速度过快，细胞没有足够的脱水时间会因为冰晶的形成而损伤或死亡；如果冷冻速度过慢，溶液逐渐由液态转变为固态，细胞长时间暴露在高渗透压的条件下过度脱水，胞内溶液浓度增加，造成细胞损伤或死亡。冷冻保护剂分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，其中，冷冻保护剂的对细胞的毒性作用被认为是限制冷冻保存成功的最大因素[3]。所以，选择合适的冷冻速率以及冷冻保护剂的类型、浓度等，尽可能减小保护剂的毒性作用，降低细胞内形成冰晶的程度，减小冷冻损伤，对于体外受精、胚胎移植等生物技术的发展具有重要作用。

图2：不同冷冻速率下冰晶形成示意图

1.渗透性冷冻保护剂

渗透性冷冻保护剂（P-CPAs）由于分子量较小，能够自由的通过细胞膜进入到细胞内，提高细胞内液体的粘滞系数和溶质浓度，从而抑制细胞内冰晶的产生，减轻冷冻及复温过程中细胞皱缩和渗透性肿胀[4]，主要包括甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和酰胺，其中甘油在精液的冷冻保存技术中应用最为广泛。P-CPAs的浓度越高，保护效果越好，但是对细胞的结构和功能造成的损伤就会越明显。在加入P-CPAs的过程中，随着渗透梯度和化学梯度的变化，会发生P-CPAs进入和水离开细胞，细胞体积会发生变化，体积的变化和渗透压的变化会影响细胞的生存能力[5]。

图3：渗透性冷冻保护剂对细胞发挥作用示意图

1.1甘油

以甘油为例，根据精液冷冻保护剂的缓冲效果和成分组成,传统上主要将精液冷冻保护剂分为三种:单一甘油型精液冷冻保护剂、复合甘油型精液冷冻保护剂和无甘油型精液冷冻保护剂。甘油的作用机理为抑制细胞内冰晶的形成,有效防止精子冷冻损伤,从而提高精子冷冻解冻后的活力和活率[6]。但研究发现，甘油对精子有毒害作用，它不仅会影响细胞微管和微丝的组成和功能，损伤精子细胞骨架，而且能使蛋白质变性、肌动蛋白相互作用及破坏精子线粒体及质膜完整性，甚至对受精后胚胎的发展产生不利影响[4]。还有研究发现，精子能利用甘油进行有氧代谢,导致有毒代谢产物如丙酮醛的积累,丙酮醛能介导磷脂酶类和朊酶类活化引起细胞不可逆的损伤[6]。并且甘油量添加过高时，精子的顶体膜结构会受到损伤，导致解冻后精子的受精能力下降[4]。而且甘油由于分子量相对较大（相对分子质量92），渗透进入细胞的速度较慢，在平衡过程的开始阶段会导致更大的渗透压不平衡，使细胞皱缩变小，脱水严重。有报道称，如果卵母细胞受到的渗透压不均匀，会导致MII期的纺锤体被破坏[5]。

1.2二甲基亚砜、乙二醇

二甲基亚砜（DMSO）是一种具有低毒性的含硫有机化合物，能引起细胞内钙离子浓度升高、氧化亚氮生成和细胞损伤[6]。此外DMSO不仅会与蛋白质发生不可逆结合，而且易导致果糖-1，6-二磷酸酶的活性丧失。所以在使用时要考虑其浓度问题。据王峰等的研究，DMSO在溶解肝素、孕酮等方面具有很好的效果，能够增加它们的渗透性，从而促进精子获能[6]。乙二醇(EG)分子量小（相对分子质量62），渗入细胞内的速度快，在精子冷冻保存过程中具有重要意义。很多研究结果都显示乙二醇对精液冷冻的保护效果优于甘油[6]，但是乙二醇容易导致精子尾部畸形等。此外，复温时，精子对水的渗透性高于渗透性冷冻保护剂，在渗透性冷冻保护剂尚未完全渗出细胞外的情况下，大量水的进入可引起精子顶体过度膨胀、破裂，造成精子渗透性休克[4]。

1.3应用

P-CPAs造成的毒性作用不可忽视，这种毒性影响被认为是影响冷冻保存成功与否最重要的限制因素[7]。以马精子的冷冻保存为例，马属动物的精子对于渗透压变化的耐受性很低，使得它们并不适用于低温保存。有研究显示，当甘油浓度超过3.5%时，由于CPA的渗透性和对细胞骨架肌动蛋白的毒性作用，会破坏公马的精子膜，最终得出公马精子冷冻培养基中添加甘油的浓度不应超过2.5%[3]。上述提到的，甘油渗透速度慢并且具有生化毒性作用，但其目前仍然是精子冷冻保存中最常用的冷冻保护剂。所以有人提出，使用其他分子量更小、膜渗透更快的P-CPAs作为甘油的替代品，比如DMSO、乙二醇、二甲基酰胺等，但是这些替代品同样也存在着使蛋白质变性聚集等的毒性作用[8]。如何生产毒性最低的冷冻保护剂是科研人员研究的重点问题。目前常见的两种降低冷冻保护剂毒性的思路：一是通过混合使用多种P-CPAs来降低每种CPA的浓度，以达到降低毒性的目的[9]，如用80mM的谷酰胺加2%的甘油来代替3%的甘油，可以提高解冻后精子的活力[10]；二是通过P-CPAs和非渗透性CPAs混合来降低毒性，如与海藻糖和蔗糖联合使用，因为这些糖类可以通过增加稀释剂的粘度，防止细胞外冰晶的形成，并且与氢键和磷脂双分子层中的磷酸基团结合来保护膜的完整性，达到保护细胞的目的[8]。还有研究表明，将非渗透性CPAs和渗透性CPAs相结合，可以进一步提高玻璃化冷冻哺乳动物组织在解冻后的活力和功能，表明了这种冷冻保护剂方案潜在的应用价值[9]。目前将蔗糖和渗透性CPAs相结合在临床上用于人类胚胎的玻璃化冷冻，已经成功受孕并且产出存活后代[9]。也有人提出，可以通过逐步加入CPAs来缓解渗透压因素对细胞造成的损伤，但是细胞会因为长期暴露于CPAs中而受到更大的毒性损害[5]。

2.非渗透性冷冻保护剂

非渗透性冷冻保护剂分子量较大，不能穿过细胞膜，从而产生渗透压，诱导细胞脱水[11]，促进细胞玻璃化。主要包括糖类（蔗糖、海藻糖、棉子糖等）和高分子量聚合物（聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等）。

图4：非渗透性冷冻保护剂对细胞发挥作用示意图

2.1蔗糖

蔗糖可以增加稀释液的粘度，并且能够提高细胞外溶液发生玻璃化所需要的温度[9]，减少冰晶的形成；也可以与脂质双分子层中的磷酸氢键发生作用保护膜的完整性，因此有效的保护了精子头部的磷脂膜，使解冻后的精子质量得到提高[12]，作为能量代谢的一部分，可以支持精子的糖酵解和氧化磷酸化过程[13]。

2.2海藻糖

海藻糖作为非渗透性二糖，有多种抗冻机制，它在冷冻之前使细胞脱水，减少细胞内的含水量，并在生物分子表面依靠带电荷的水合基团间的氢键形成保护膜，代替了维护三级结构所必须的水分子，从而使组织在极低水分时仍保持细胞膜结构功能的完整性，避免细胞内成分的损失；它有助于避免渗透性保护剂渗入细胞所导致的过度膨胀和渗透性休克；海藻糖能代替脂质分子头部基团间的水分子,降低膜的相变温度,防止重新水化时脂质状态转换及伴随出现的裂缝；此外，海藻糖能非特异性的稳定细胞内生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子结构[14]。海藻糖通过自身抗氧化作用清除冷冻过程产生的活性氧（ROS），减少脂质过氧化反应（LPO），提高精子冷冻保存效果。海藻糖还另外显示出了极佳的玻璃化特性，经海藻糖处理后,玻璃化温度接近-30℃,它比传统渗透性保护剂的玻璃化温度(-65℃)要明显高得多。因此,玻璃化特性或许是海藻糖的另一种重要的保护性机制span=""[14]。海藻糖对精子的保护作用可能优于其他糖类（葡萄糖、蔗糖），目前已在牛、山羊、绵羊、猫、猪等多个物种上证明了海藻糖的积极作用[15]。

图5：ROS水平对蛋白质、线粒体/核DNA、脂类的影响

2.3高分子量聚合物

高分子量聚合物在玻璃化冷冻中也起到了重要作用，与糖类相似，它们也可以增加保护剂的粘度来降低细胞外冰晶的形成。它们在玻璃化冷冻中还可以取代一部分渗透性CPAs以降低CPA的毒性且不影响玻璃化性能。此外，一些高分子量聚合物还可以发挥抗氧化剂和重结晶抑制剂的作用[9]。PVP是一种由N-乙烯吡咯烷酮聚合而成的聚合性非渗透性冷冻保护剂，具有高分子表面活性、成膜性、抗冷冻性、低毒性、强稳定性等优良特性，具有成功保存多种生物细胞的能力。与渗透性冷冻保护剂组合添加到冷冻基础液中，PVP可以促进细胞外无冰玻璃化[16]。

2.4应用

与渗透性CPAs相比，非渗透性CPAs的毒性相对较低[9]。Sztein等人的研究显示，采集到的新鲜精液分别稀释于非渗透性CPAs和渗透性CPAs中，结果显示非渗透CPAs中的精子具有更高的活力，尽管在冷冻解冻后，两种CPAs中精子的活力都有所下降，但是冷冻于糖类（非渗透性CPA）中的精子活力仍然比冷冻于乙二醇（渗透性CPA）的高[17]。

近些年来，通过将蔗糖与人类或牛的血清蛋白相结合的保护剂，已经应用于人类、狗、驴等动物精子的玻璃化冷冻过程，这类保护剂可以降低渗透压失衡，避免了P-CPAs对细胞固有的毒性作用和渗透损伤[8]。其中找到蔗糖的适宜浓度是该方案能否运用的重要因素。以马属动物为例，C.Consuegra等人的实验结果显示，在不添加P-CPAs的情况下的情况下，用mM蔗糖和1%牛血清白蛋白作为替代，可以用于公马精子冷冻[8]。Aboagla和Terada等人的研究显示，在冷冻保护剂中加入高浓度的海藻糖可以在冷冻前增加膜的流动性，可以增加精子对冷冻和融化过程中的抵抗力[11]。

除了上述提到的几种非渗透性冷冻保护剂，卵黄也是一种重要且在哺乳动物中被广泛使用的冷冻保护剂。卵黄中能有效保护精子的成分是卵磷脂和低密度的脂蛋白，卵磷脂作用于精子质膜上，可以防止精子发生冷休克；在冷冻保存过程中低密度脂蛋白会吸附到精子细胞膜上，保护精子膜磷脂的完整性，起到稳定质膜的作用[12]。

尽管精子冷冻保存技术在实际生产中已经取得了广泛应用，冷冻过程中由于温度变化、冰晶形成和渗透压胁迫等对精子造成的致命危害仍然没有得到有效的解决，相关的生物学机制也仍需进一步阐明，精子冷冻技术继续深入研究，提高该技术的生物安全性，确保后代的健康，无论是对于人类辅助繁殖技术还是提高家畜的生产性能都有重要意义。

参考文献

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