冰冻血小板在出血治疗中的应用
重症一隅翻译组
引言
血小板产品在室温下保存，保存期限为5-7天，此后需要丢弃。这种有限的血小板储存时间对确保血库的持续供应构成了明显的挑战，特别是在严峻的环境下和大规模输血的情况下。由于高浪费，医院可能无法全天候提供血小板产品。血小板产品的超低温保存为供应提供了一种解决方案，并将解决过期产品的浪费。几十年来，荷兰军方在海外行动中一直使用冰冻血小板。然而，冰冻血小板的广泛使用尚未实施，这可能是由于观察到的血小板在冷冻和解冻过程后的变化。解冻和再悬浮后，冰冻的血小板变得高度活化。在体外测试中聚集和粘附力受损与血小板肿胀和受损有关。与液体血小板相比，输注融化的冰冻血小板在志愿者中的恢复率较低。总而言之，这些变化引起了人们对冰冻血小板疗效的担忧。但是，低的恢复率与血小板的低止血能力无关。相反，冷冻保存过程甚至可能增强凝血反应的某些过程。这可能归因于血小板的活化，导致细胞外囊泡含量增加，这有助于凝血过程。在接受心脏手术的患者中，用冰冻血小板治疗的几项小试验的结果也表明凝血能力增强。
因此，冰冻血小板对凝血的影响与正常(液体)储存的血小板不同。如果冰冻血小板的使用在加强止血方面更好，我们可能会开始考虑将血小板产品区别使用于特定适应症的可能性，例如使用冰冻血小板用于活动性出血，使用液体储存的血小板用于纠正血小板减少症。在采用这种方法之前，应该确定冰冻血小板对止血有什么作用，以及冰冻血小板是否安全。使用冰冻血小板可能会增加血栓栓塞事件的风险，或有其他副作用，如助长炎症反应。在本章中，我们将总结冻融循环对血小板的影响，以及体内和体外相关的功能变化，为使用冰冻血小板作为止血剂提供理论依据。冷冻血小板在世界各地的军事环境的使用的经验也进行了介绍，以及在几个特定患者群体中进行的试验数据。
冰冻血小板的制作
纵观整个历史，已经使用了许多不同的冷冻方法和不同的添加剂溶液来冷冻保存血小板产品。如今，通过这些实践已经形成了一种能稳定保存冷冻血小板的方法，即血小板冷冻浓缩在5-6%的二甲基亚砜(DMSO)中，冻存的血小板在-80°C保存最长2年。当需要时，这些冷冻的血小板被解冻并重新悬浮在血浆中，然后直接给患者使用。制造过程中对冻融和再悬浮血小板的功能有多方面的影响。
冻融对血小板的影响
1形态学血小板的形态取决于其活化状态。新鲜提取的血小板呈盘状，但收集后形状变化非常迅速。血小板在室温下储存在血浆中时，会从盘状转变成球状。圆盘对光的折射与球体或聚集体不同。圆盘状血小板的运动也不同于溶液中球体状的运动，这是由它们的大小和溶液的密度决定的。血小板的冷冻和解冻由于对血小板的损害而导致形态变化，重悬后约75％的血小板恢复。在冷冻前向存储溶液中添加5–6％DMSO可以部分防止膜完整性的丧失，从而稳定细胞骨架和血小板膜。用5-6%二甲基亚砜保护的冷冻血小板在冻融周期中存活。可以使用Kunicki形态评分系统，“涡流”测试和Thrombolux技术测量形态变化。由于形态变化和大量细胞外囊泡，与正常储存的血小板相比，冻融的血小板显示出更少的涡流，较低的Kunicki评分和较低的Thrombolux评分。正常储存的血小板和冷冻的血小板之间的形态差异如图所示。总的来说，这些变化揭示了激活的表型。
图：标准储存和冰冻血小板的形态。相差显微镜观察戊二醛固定的正常储存（上部）和冻融的血小板（下部）。黑色条形表示长度为5.0μm
2活化状态加入冷冻保护剂DMSO可减少冻融对血小板膜的损伤。然而，尽管使用不同方法的研究有很大的差异，但即使添加了DMSO，冻融的血小板仍然具有活化的表型，这已经通过P-选择素（CD62P）的较高表达所证明，高表达是由于胞吐的血小板α颗粒引起的。在解冻后的储存过程中，P-选择素的表达进一步增加。P-选择素在血管损伤区域血小板的募集和聚集中起作用。因此，活化的血小板状态可能有助于增强凝血功能。
3磷脂酰丝氨酸外翻和胞外囊泡脱落除了上调P-选择蛋白向血小板外膜的胞吐作用外，冷冻血小板的细胞内钙水平高于液体储存的血小板。人们认为，较高水平的细胞内钙水平会诱导磷脂酰丝氨酸外翻，从而导致外膜带更多的负电荷，从而导致血小板形状的不对称性丧失。磷脂酰丝氨酸的暴露对于凝血因子复合物的连接至关重要，凝血因子复合物是凝血酶生成所必需的。此外，冰冻血小板中较高的细胞内钙水平与细胞外小泡释放较多有关。细胞外囊泡（包括微粒和外泌体）是小于nm的磷脂包裹的囊泡，其直径通常比细胞小倍。活化后，血小板释放细胞外囊泡。对冻融血小板浓缩的胞外囊泡含量的估算值因检测方法和实验设置有所不同。当使用相同的检测方法时，细胞外囊泡含量的数量在血小板总数的15％到40％之间变化。冻融后，与冰冻前水平相比，胞外囊泡约为之前的15倍。随着细胞外囊泡从活化的血小板中萌发，磷脂酰丝氨酸也在血小板衍生的胞外囊泡上大量表达，这可能增强了凝血过程。
冻融对体外凝血功能的影响
1血小板聚集vonWillebrand因子(vWF)和纤维蛋白原增强了活化血小板的聚集。糖蛋白（GP）2b3a的表达在冻结过程中不受影响，它既是vonWillebrand因子又是纤维蛋白原的受体。冻结会部分激活GP2b3a，从而导致PAC-1结合减少，并且凝血酶受体激活肽（TRAP）刺激的PAC-1结合比液体储存的血小板要低。尽管不同生产位点报道的结果不同，但是似乎GP1b表达（即vonWillebrand受体）在所有或部分冷冻血小板的亚群中都降低了。这些GP1b减少的血小板降低了PAC-1的结合率。此外，较低的GP1b受体表达与减少的聚集反应相关。因此，与新鲜的液体储存的血小板相比，冷冻的血小板在体外的聚集能力似乎降低了。因此，与新鲜的液体保存的血小板相比，冷冻的血小板在体外的聚集能力似乎有所降低。然而，与正常储存的血小板相比，在冰冻的血小板中发现了其他促进血小板聚集的物质，如血栓素。
2凝血酶生成尽管与液体储存的血小板相比，冷冻血小板的体外凝集减少了，但冷冻血小板中凝血酶的产生潜力却有所提高。如前所述，冷冻的血小板及其衍生自血小板的细胞外囊泡的磷脂酰丝氨酸表达增加。由于磷脂酰丝氨酸能够结合凝血因子V和X，并且对于凝血因子复合物的连接必不可少，因此磷脂酰丝氨酸的较高表达与更早的凝血酶和更丰富的凝血酶生成有关。
3粘弹性试验所有使用粘弹性测试(如血栓弹力图(TEG)和旋转血栓弹性测量仪(Rotem))对其冰冻血小板进行表征的研究都显示出相同的结果：与液体血小板相比，冰冻血小板的凝血时间更短，这表明凝血的启动速度更快，而凝血强度却降低了。在图26.2中，显示了正常液体储存的血小板、冷冻的血小板和血浆的KaolinTEG轨迹的典型图形。在不同的研究中，在kaolinTEGR-time中，冷冻血小板的凝血时间从8分钟缩短到5分钟，这与凝血时间减少了约38％有关。较短的凝血时间与冷冻血小板较高的血栓形成能力高度相关，这与磷脂酰丝氨酸阳性血小板和磷脂酰丝氨酸阳性血小板衍生的细胞外囊泡比例高有关。冰冻血小板凝块强度的降低(TEG中的最大振幅[MA]或Rotem中的最大凝块硬度[MCF])与血小板上GP1b表达的降低有关，而在粘弹性试验中，胞外囊泡对凝块强度没有贡献。因此，冷冻的血小板似乎比液体储存的血小板诱导凝血更快，总体凝血强度更低。这些结果强调了体外试验：凝血时间越短，凝血酶生成潜力越高，而凝血强度越低，血小板聚集性越低。
图：正常储存和冰冻血小板的血栓弹力图（TEG）轨迹。冷冻和正常储存的血小板的典型TEG结果具有缩短的R时间和降低的最大振幅（MA）。
4流动凝结模型在流动模型中，血小板以不同的速率在涂层表面或血管段上流动。这些模型可以用来研究不同实验条件下影响血小板向血管壁边缘聚集的因素。冷冻血小板的生产过程在流动模型中并未导致纤维蛋白沉积的改变，这表明冷冻血小板可以充分刺激了纤维蛋白的形成。在另一个使用流动模型的实验中，与液体储存的血小板相比，冷冻的血小板导致相同量的纤维蛋白沉积。由于冰冻血小板减少了GP1b受体的表达，减少了血小板的结合力，因此在流动模型中，胞外囊泡浓度的增加可能是冷冻血小板形成纤维蛋白的等效原因。与完整的血小板相比，较小的细胞外囊泡可能更容易与血管壁相互作用并引发纤维蛋白形成。与这一思想一致，在流动模型中，血小板来源的细胞外小泡被证明与固定的胶原、纤维蛋白原和vonWillebrand因子结合，凝血酶的产生增加。这些数据在机械性血管内皮细胞壁损伤的啮齿动物模型中得到进一步证实，在该模型中，血小板衍生的标记细胞外小泡的输注与细胞外小泡与受损内皮壁的粘附性增加有关。
综合体外凝血数据，与液体储存的血小板相比，冷冻的血小板显示增加的凝血激活，减少的聚集和增加的凝血酶生成潜能。在血流模型中，功能性纤维蛋白的分布没有区别。
冰冻血小板的清除
大多数血小板的体外评价在预测体内功能方面价值有限。冰冻血小板已经在狗、兔子、老鼠和狒狒身上进行了研究。在狒狒中输注后，与新鲜血小板相比，冷冻血小板显示出更快的清除率，这取决于GP1b的表达。GP1b表达减少的整个冰冻血小板亚群在5分钟内从循环中清除，而GP1b表达正常的冰冻血小板亚群中有48%存活1-2小时，总寿命与正常储存的血小板相似(略少于6天)。磷脂酰丝氨酸和P-选择素介导内皮细胞对血小板源性胞外囊泡的内吞作用。血小板衍生的胞外囊泡从循环中快速清除。血小板减少症患者液体储存的血小板来源的胞外囊泡的半衰期为5-6小时。由于冷冻的血小板衍生的细胞外囊泡比正常储存的血小板胞外的囊泡包含更多的表面标记，因此冷冻的血小板衍生的细胞外囊泡的半衰期可能更快。
冰冻血小板在活体实验中的作用
尽管输血后冷冻血小板清除速度更快，但血小板止血的效果可能会增强。在用阿司匹林治疗的狒狒(n=5)中，输注冷冻血小板，而不是72小时液体储存的血小板，减少了出血时间。冰冻血小板也增加了这些狒狒体内血栓素的水平。这些发现得到了在以mg阿司匹林进行预处理的人类志愿者（n=42）中进行的较早试验的进一步支持，这些人接受了采用不同方法进行储存的自体血小板输注（每组8至12名志愿者）。在这些志愿者中，用冷冻血小板输血后出血次数减少，但用正常储存的血小板输血后出血次数不减少。这些数据在另外两个用阿司匹林预处理的健康志愿者身上重现，在这些试验中，冷冻的血小板能够显著减少出血时间。
在军事环境中使用冷冻血小板的经验
冰冻血小板的技术是由美国海军在20世纪70年代开发的。年，荷兰军方血库采用了一种改进的血小板冷冻方法，包括用解冻的AB型血浆代替生理盐水，在解冻后重新悬浮血小板。年4月，在波斯尼亚战争期间，荷兰军方首次使用了这种产品。迄今为止，荷兰军方仍然是唯一在国外行动中使用冷冻血液产品治疗出血性创伤患者的国防组织。荷兰军事血库生产的冷冻血小板可在荷兰的医疗设施以及联军在国外进行的相互合作的某些治疗设施中获得。年至年间，名出血患者输注了冷冻血制品，其中名患者接受了份冰冻血小板。这些患者每位患者平均输注了2U[IQR1-4]冰冻血小板。到目前为止，只有两名患者在输注1U冰冻血小板后观察到两种轻微的输血反应(荨麻疹)。与年荷兰液体储存血小板的输血反应率（每0个血小板制品有4-5个出现反应）相比，这些轻度的输血反应相对较低。
在阿富汗战争期间（-年）的塔林·科沃特（TarinKowt）的治疗设施中，冷冻血小板是唯一可用于治疗创伤性出血患者的血小板来源。在TarinKowt，引入了大量输血程序方案。与以前的推荐相比，这种方案导致血浆（中位数4-6U）和冷冻血小板产品（中位数2-3U）的更多使用。引入大量输血程序后，尽管创伤评分更高，但大量（5URBC/24h）输血的创伤患者的院内死亡率从44％降低至14％。与接受类似输血方案治疗但含有液体储存血小板的平民和军事创伤的患者的死亡率相比，两者死亡率是相似的。这些数据表明，在军事伤亡治疗中使用冰冻血小板是安全有效的。荷兰在军事行动中冰冻血小板的经验促使许多国家向荷兰军事血库学习这一流程，并开始研究和生产冰冻血小板。荷兰军方目前正在准备一项临床非劣效性临床试验，以比较冷冻血小板与荷兰正常储存的血小板在创伤和血管外科手术患者中的功效。
冰冻血小板临床试验
1纠正血小板减少大多数早期的冰冻血小板试验都是在肿瘤科血小板减少患者中进行的。在年之前的肿瘤患者试验中，恢复的比率较低，输注后冷冻血小板的存活率与正常储存的液体血小板相似。然而在这些患者中，冰冻血小板在减少出血次数和预防出血事件方面更具优势。最近，对患有（血液学）恶性血小板减少症的患者进行了多中心剂量递增随机试验。患者被随机分配接受正常储存或不同剂量（0.5、1、2或3U）的冰冻血小板。共有28例患者随机。其中24例接受不同剂量的冰冻血小板，4例为正常储存血小板。与接受标准血小板制品的患者相比，接受冰冻制品的患者的血小板计数增量大约低6倍，这与以前的试验一致。在该试验记录没有发生出血事件和血栓事件。此外，没有观察到与冰冻血小板输注有关的严重不良事件。在三例接受冷冻血小板治疗的患者中发生了轻微反应，从轻度发冷和发热到DMSO皮肤异味。在接受正常储存血小板治疗的四名患者中，未观察到不良事件。
2出血的治疗最近，对出血性多创伤患者（n=46）进行了病例对照研究，其中25例患者接受了冷冻血液制品。与冰冻血小板治疗的患者相比，正常储存血小板治疗的患者的血液制品量没有差异。与正常储存血小板组相比，冷冻血小板治疗的患者输血后血小板计数较低(41.5×vs.97×/l)。
在最近的一项试点临床试验中，随机选择位心脏外科手术患者接受冷冻保存或标准保存的血小板来治疗围手术期出血（CLIP-1试验），该试验随机选择了名患者；然而，只有41名患者接受了指定的治疗，而其余患者中，临床上没有提示需要输注血小板的。与随机分配到正常储存产品的患者相比，随机分配到冷冻产品的患者输血后血小板计数较低(×vs.×/l，,p=0.02）。然而，与正常储存的血小板相比，冰冻血小板与出血并发症的减少有关，尽管没有达到统计学意义（30.4%对55.6%）S，p=0.1）。患者接受的中位数为2U冷冻血小板或1U液体储存血小板。对两组间血小板输注量差异的一种解释可能是，医生的目标是血小板增量，与正常储存的血小板相比，冷冻血小板的血小板增量更低。有趣的是，在CLIP-1试验中，与随机分配到正常储存血小板的患者相比，分配到冷冻血小板的更多患者(n=23)输注了新鲜冷冻血浆(FFP)。接受FFP治疗的患者接受同等剂量(中位数2U)。在接受冷冻血小板治疗的患者中发现更多的FFP输注与心脏手术患者的早期试验相矛盾。在这项早期试验中，73名接受心脏手术的患者被随机分为输注冷冻血小板或正常储存血小板。与的正常储存血小板相比，冷冻血小板减少了失血量，减少了血制品的使用（包括FFP在内）。冰冻血小板在心脏外科手术中的两个最大临床试验之间存在这种差异的原因尚不清楚。
冰冻血小板的安全性
冰冻血小板可能具有炎性特性，因为与新鲜液体血小板相比，它们含有更多的可溶性P-选择素，产生更多的趋化因子配体5（CCL5），并且可溶性CD40配体的水平较低。可溶性P-选择素水平升高提示血小板活化增加。CCL5是一种趋化分子，参与T细胞和自然杀伤细胞的激活。可溶性CD40配体可激活内皮细胞。此外，冰冻血小板被巨噬细胞吞噬，也会产生炎症反应。与正常储存的血小板相比，肿瘤坏死因子（TNF）-α，白介素（IL）-1β和转化生长因子（TGF）-β的释放增加，以及与新鲜储存的血小板相比，IL-6的增加也证明了这种反应。最近，在体积控制性出血的小鼠模型中，与输注液体存储的血小板相比，输注冷冻的血小板与肝脏中促炎性细胞因子的浓度更高有关。相比之下，在与树突细胞孵育后，观察到冰冻血小板孵育的免疫抑制作用，因为与未输注对照相比其促炎细胞因子水平明显降低。然而，到目前为止，在肿瘤患者的各种试验和最近对出血患者的试验中还没有报告严重的不良事件。如前所述，在军事经验中，在使用冷冻血制品治疗的名患者中，只观察到两个轻微的(荨麻疹)反应。
因此，当将体外数据转化为临床情况时，输注冷冻保存的血小板后炎症反应增强的证据有限。这可能是由于冻融的血小板及其衍生的细胞外囊泡的快速清除所致。但是，应该指出的是，缺乏关于并发症的前瞻性研究。
浅谈不同用途的血小板制品
解冻和再悬浮的冷冻血小板似乎被激活，聚集特性减弱，但凝血酶生成潜力增加。在粘弹性测试中，较低的凝血时间表明形成凝块的起始速度更快。在出血患者中，由于这些早期止血能力，冰冻血小板似乎很有希望，冰冻血小板从循环中清除也要快的多。然而，当出血停止时，输注血小板的清除率增加可能不会对病人有害，甚至可能有益。相反，鉴于较高的存活率，新鲜的液体储存的血小板可能仍然是纠正血小板减少症的首选。但是，在室温下保存几天可能会对这些产品的血小板存活时间产生负面影响。当血小板存活是关键时，数据表明应输注新鲜的正常储存的血小板。
结论
总之，在出血患者的初步临床试验中，有关早期止血活性和冷冻保存血小板的使用的数据很有希望。未来的方向应该集中在验证以前在大量出血的平民患者的不同亚群中的试验结果。在这些试验中，积极筛查不良事件仍然是必要的。
编辑：邓彪审校：李振龙龙肖啸
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